王 燕，俞春英，周建华，杨燕燕，谢金东，钟秋明，王训立
（福建中医药大学，福州 350122）
环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)是1957年合成的烷化剂，是一种较广谱的抗肿瘤药物[1]。CTX进入体内后，经肝脏的酶催化和烷化等作用下，分解产生的磷酰胺氮芥对肿瘤细胞有抑制功能，对治疗多种类型的肿瘤效果显著，特别是对恶性淋巴瘤效果明显，其次是慢性粒细胞白血病，还有对急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓病、肺癌、卵巢癌等也有理想的疗效[2]。目前，在临床上，环磷酰胺作为治疗肿瘤的常用化疗药物[3]。
近年来，CTX作为免疫抑制剂在治疗免疫性疾病方面应用受到广泛关注[4]，CTX通过活化烷化的基团与机体细胞的蛋白质和核酸中氨基、羧基、巯基、磷酸基等亲核基团相互作用，烷基取代亲核基团中的氢原子，再与DNA的双链交叉连接，烷化作用的结果，造成DNA的结构和功能损伤[5]，为此，环磷酰胺对机体免疫功能也有显著抑制作用，主要表现在对机体的器官造成损伤，特别是对肝脏和肾脏的功能有严重的影响[6]，因此，环磷酰胺也是制备免疫抑制动物模型的药物。
CTX作为烷化剂的免疫抑制剂，具有作用力强、持续时间长等特点，在临床上主要在移植和治疗免疫性疾病等方面应用，但是，CTX对免疫系统的作用机制尚未有比较全面和系统的了解[7]。制备免疫抑制动物模型，对CTX进一步深入研究，使其发挥更好的临床效果，具有重要的意义。
福建黄兔是福建省古老特有的家兔品种之一，筛选福建黄兔作为新型的实验动物，具有独特的地方资源优势[8]，近几年已有一些相关的报道[9]。本实验通过不同剂量的环磷酰胺对福建黄兔外周血中电解质、肌酶、血糖、血脂、肝功能、肾功能的指标分析，为探索环磷酰胺制备福建黄兔免疫抑制动物模型，提供实验参考依据。
1.1 实验动物
福建黄兔18只，体重为(2.2±0.2)kg，4月龄，来源于福建省连江玉华山自然生态农业试验场提供。在福建中医药大学实验动物中心动物实验室适应性饲养5天（实验动物使用许可证SYXK[闽]2020-0003），随机分组进行实验。
1.2 试剂与仪器
环磷酰胺(25 g)，购自上海源叶生物有限公司（批号：X13J11Y115691）；
生化指标检测采用日立诊断产品（上海）有限公司生产的日立7180全自动生化分析仪。
1.3 给药剂量
模型组：每日上午，腹腔注射环磷酰胺（生理盐水溶解），剂量分别为20、40、60、80、100 mg/kg，连续7天；
对照组：腹腔注射生理盐水。
1.4 采集样品
实验结束后次日（第8天），采用腹腔注射30%乌拉坦注射液（3.5 mL/kg体重）麻醉动物，通过耳缘静脉取血约2 mL，常温静置10 min后，3000 rpm，离心20 min，收集血清样品于Eppendorf管中，-20℃冰箱保存，待测。
1.5 生化指标检测
应用日立7180全自动生化分析仪，测定福建黄兔外周血的生化指标。
1.6 数据处理
实验所得数据用x±s表示，使用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。
2.1 不同剂量环磷酰胺对黄兔电解质的影响
随着环磷酰胺的剂量增加，外周血的Na、Cl、Ca、碳酸氢根、阴离子间隙、渗透压等水平显著低于对照组(P＜0.01)；
而外周血的K、Mg、P水平随着环磷酰胺的剂量增加显著高于对照组(P＜0.01)，见表1。
表1 不同剂量环磷酰胺对黄兔电解质的影响 mmol/L
2.2 不同剂量环磷酰胺对黄兔肌酶的影响
不同剂量的环磷酰胺对黄兔外周血的乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)水平有明显差异(P＜0.05)，见表2。
表2 不同剂量环磷酰胺对黄兔肌酶的影响 U/L
2.3 不同剂量环磷酰胺对黄兔血糖的影响
不同剂量的环磷酰胺对黄兔外周血的葡萄糖(GLU)水平有显著差异(P＜0.01)，见表3。
表3 不同剂量环磷酰胺对黄兔血糖的影响 mmol/L
2.4 不同剂量环磷酰胺对黄兔血脂的影响
随着环磷酰胺的剂量增加，外周血的CHOL、TG水平随着环磷酰胺的剂量增加显著高于对照组(P＜0.05)；
外周血的HDLC、LDLC、A1APOA1、BAPOB等水平显著低于对照组(P＜0.01)；
而不同剂量的环磷酰胺对黄兔外周血的B/A1水平没有显著差异(P＞0.05)，见表4。
表4 不同剂量环磷酰胺对黄兔血脂的影响 mmol/L
2.5 不同剂量环磷酰胺对黄兔肝功能的影响
随着环磷酰胺的剂量增加，外周血的TP、ALB、GLB等水平显著低于对照组(P＜0.01)；
外周血的总胆红素(TBIL)、直接总胆红素(DBIL)、间接总胆红素(IBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)、AST/ALT、碱性磷酸酶(ALP)水平随着环磷酰胺的剂量增加显著高于对照组(P＜0.05)；
而不同剂量的环磷酰胺对黄兔外周血的A/G水平没有显著差异(P＞0.05)，见表5。
表5 不同剂量环磷酰胺对黄兔肝功能的影响 μmol/L
2.6 不同剂量环磷酰胺对黄兔肾功能的影响
不同剂量的环磷酰胺对黄兔外周血的尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、尿酸(UA)水平有显著差异(P＜0.01)，见表6。
表6 不同剂量环磷酰胺对黄兔肾功能的影响 mg/kg
环磷酰胺又称环磷氮芥(Cytoxan，Endoxan，CTX)，是制备免疫抑制动物模型应用最多的药物之一，其在生物体外无活性，在体内，环磷酰胺经肝脏细胞色素P450的氧化作用下，产生醛磷酰胺(aldophosphamide)等中间物质，再经过肝微粒体的酶催化作用，形成丙稀醛(Acrolein)、磷酰氮芥(Phosphamide mustard)、去甲氮芥(Normustard)等重要产物，与细胞的脱氧核糖核酸(DNA)发生烷化作用[10-12]，引起细胞毒性。
环磷酰胺产生细胞毒性的重要物质是丙烯醛，其主要通过修饰谷胱甘肽巯基组作用，形成巯基尿酸后，经肾脏排出体外。丙烯醛通过诱导细胞中的氧化应激和蛋白质羰基化等作用，对肝脏和肾脏造成明显的毒性作用[13-14]。实验结果表明：CTX对肝功能有显著的变化，TP、ALB、GLB等水平显著偏低；
TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、AST/ALT、ALP水平随着环磷酰胺的剂量增加显著升高；
A/G水平没有明显差异。而BUN、CR、UA水平有显著升高，说明环磷酰胺可致肾脏发生病变。
大剂量液体和高剂量CTX(＞80 mg/kg)同时给予时，容易引起水中毒现象，出现严重的低钠血症，同时出现血肌酐升高，对肾小球滤过功能造成严重的影响[15]。实验结果发现：CTX对电解质的影响明显，Na、Cl、Ca水平显著低于对照组，环磷酰胺造成肾障碍、功能减退；
K、Mg、P水平随着环磷酰胺的剂量增加显著高于对照组，说明环磷酰胺可导致肾功能不全；
环磷酰胺造成机体代谢功能的紊乱，导致营养不良，引起碳酸氢根、阴离子间隙、渗透压水平偏低。
CTX可引起心血管系统的损害，研究报道大剂量CTX(＞80 mg/kg)造成出血性心肌坏死，甚至引起心力衰竭[16]。实验结果显示：不同剂量的CTX对LDH、CK、CKMB水平有明显影响，由于环磷酰胺造成机体的肝脏、肾脏受损，代谢功能障碍，形成肌营养不良、心脏功能受损导致LDH、CK、CKMB增高。
由于CTX对肿瘤细胞和正常细胞的选择性不高，对骨髓、淋巴组织、胃肠粘膜、毛囊等均有抑制，降低机体免疫力，临床应用中作为免疫抑制剂，主要为治疗自身免疫性疾病，及移植手术中用来抑制宿主抗移植的免疫反应[17]。
目前，CTX的免疫抑制机制目前尚不十分清楚，伍维高等[18]认为CTX可以有效抑制B细胞活性和自身抗体的形成，而对T细胞作用则比较复杂。大剂量时产生免疫抑制，如诱导淋巴细胞核损伤，代谢功能受抑，增殖受抑，B细胞比T细胞对CTX更敏感；
低剂量时可以增强免疫反应，通过抑制T细胞封闭因子，降低Ts细胞活性使T细胞充分发挥免疫作用。
CTX作为抗肿瘤药研究比较深入，但作为免疫调节剂使用时间不长，其作用机制和临床应用尚有许多需深入研究的问题。有关CTX对免疫系统的影响有待后续进一步研究。
实验证实：CTX对福建黄兔外周血生化指标有显著的影响，不同剂量的环磷酰胺对外周血的电解质、肌酶、血糖、血脂、肝功能、肾功能等指标与对照组比较有显著的变化，并呈现剂量依赖关系。随着环磷酰胺剂量的升高，提示环磷酰胺对福建黄兔的肝脏和肾脏可能产生不同程度的毒性作用。而不同剂量的环磷酰胺可造成福建黄兔不同程度的肝肾组织损伤[19]。
福建黄兔是福建兔黄毛系的优质家兔品种，具有适应能力广、抗病能力强、繁殖能力高等优点[20]。本实验利用福建黄兔的免疫反应优势和体征优势，通过环磷酰胺对福建黄兔免疫抑制作用的研究，为探索环磷酰胺制备福建黄兔免疫抑制动物模型提供实验参考，为开发一种经济简便、具有良好应用性、重复性好的福建黄兔免疫抑制动物模型提供理论依据。
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