彭彤，马少兰，马彩霞，宋燕芳，高娜，李凯乐，张传继，李静雯，纳小凡，王立光*
（1.兰州大学生命科学学院，甘肃 兰州 730000；
2.细胞活动与逆境适应教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000；
3.宁夏大学生命科学学院，宁夏 银川 750021；
4.甘肃省农业科学院生物技术研究所，甘肃 兰州 730070）
宁夏枸杞（Lycium barbarum）为茄科、枸杞属多年生多分枝灌木，其果实营养丰富，具抗肿瘤、抗炎等多种生物学活性［1-2］，极具经济价值。加之枸杞具有极强的耐盐、耐旱和耐贫瘠等特征［3］，非常适合在我国西北干旱、半干旱生态脆弱区栽培［4］。枸杞种植业已成为区域经济增长和农民经济增收的特色农产业之一。据统计，2020年我国枸杞干果产量达44.1万t，其中出口12766.7 t、出口金额达10882.1万美元［5］。然而，在连年单作的情况下，枸杞出现产量降低、品质下降及土传病害增加等连作障碍现象［6-8］，严重阻碍了枸杞种植业的可持续发展，对我国西北欠发达地区“乡村振兴”计划的实施和推动造成了负面影响。
研究表明，连续单作18年的枸杞园表层土壤全氮和有效磷含量分别增加至1.7 g‧kg-1和114.2 mg‧kg-1［6］，但这些元素的积累并不能维持枸杞的产量和品质［7-8］。长期单作导致的次生盐碱化通过抑制枸杞根系活性、诱导根细胞氧化损伤等来影响枸杞生长［9］。对单作条件下土壤微生物群落的研究发现，长期单作降低了枸杞地土壤真菌群落多样性、诱导枸杞根际和非根际土壤细菌与真菌比值分别降至对照样地的67%和37%，导致再植枸杞根际土壤微生物环境偏向于真菌型［10］。其中，土壤理化性质改变是单作下枸杞园土壤微生物群落变异和多样性损失的主要因子［7，11-12］。进一步研究发现，长期单作诱导了镰刀菌属等植物病原真菌在枸杞根际大量富集［7，11］，这一现象与枸杞根际土壤细菌群落结构变异和枸杞-根际细菌群落解偶联有关［11，13］。
作为分解者，土壤微生物群落的代谢活性和生理特征对其生态功能的实现具有重要作用［14］。虽然前期对枸杞园土壤微生物响应长期单作的微生物生态学机制进行了详尽研究，但就长期单作如何影响土壤微生物的代谢活性仍不明确，这一研究空缺阻碍了对枸杞连作障碍形成机制的认知。为研究长期单作对枸杞园土壤微生物代谢活性和底物利用谱的影响，本研究利用Biolog Eco平板分析了枸杞园表层和亚表层土壤微生物代谢活性的年代变化规律，探究了土壤理化性质、酶活性和微生物代谢活性间的关系，为深入理解枸杞连作障碍形成机制提供了参考。
1.1 土壤样本采集
本研究分别在宁夏银川市南梁农场（种植1、9、17和20年，N1、N9、N17和N20）和石嘴山市惠农区（种植5、15和20年，H5、H15和H20）选取了7个不同种植年限的枸杞地。两个采样区域均属于温带大陆性半干旱季风气候，年平均降水量分别为153.1和143.0 mm，年平均温度分别为9.1和9.0℃。区域内选择种植密度（每hm24200～4400株枸杞）和管理措施（即灌溉和耕作方法、施肥量和频率）相同的枸杞地为样地［12］。其中，所选样地施肥量为每年每hm2施加900 kg N、600 kg P2O5和400 kg K2O。每个样地中随机设置3个10 m×10 m的样方，样方间距50 m。利用土钻在距离枸杞茎15 cm处采集表层（0～20 cm）和亚表层（20～40 cm）土壤，每个样方内随机采集10点，后分别合并成表层和亚表层土壤样本。试验共采集表层和亚表层土壤各21个样本。
1.2 土壤理化性质分析
本研究所有土壤样本采集于2017年4月完成。新鲜土壤带回实验室过2 mm筛，去除植物碎片并充分混匀。一半样品阴干，用于理化性质分析；
另一半立即用于Biolog Eco平板、酶活性和含水量测定。采用烘干法测定土壤含水量［15］。分别使用pH计（sartorius PB-10，德国）和电导率仪（mettler toledo FE38，上海）测定土壤pH和电导率，土（干重）水比为1∶5（w/v）［16］。采用重铬酸钾法测定土壤总有机碳含量，采用Kjeldahl法测定总氮含量，用HF-HClO4消化后采用钼蓝比色法测定土壤总磷含量，利用碱解扩散法测定碱解氮含量，采用钼锑抗比色法测定速效磷含量，利用乙酸浸提法测定速效钾含量［17-19］。参照张甘霖等［20］和姜庆利等［21］的方法测定土壤黏粒含量。
1.3 土壤主要酶活性测定
参照Na等［12］的方法测定土壤脱氢酶活性。脲酶以尿素为底物，以尿素降解速率表示酶活性［22］。蔗糖酶活性利用单位时间内葡萄糖生成量表示［23］。土壤酸性磷酸酶以对硝基磷酸苯二钠为底物，以单位时间内对硝基苯酚的生成量计算酶活性［12］。参照Kandeler等［24］的方法测定土壤蛋白酶活性，以酪蛋白为底物，利用分光光度法测定。
1.4 土壤微生物群落碳源利用多样性分析
称取相当于5 g干重的新鲜土壤至100 mL三角瓶中，加入45 mL无菌磷酸缓冲液（pH=7.4），置于28℃摇床180 r‧min-1振荡10 min。静置3 min，吸取3 mL上清液至含27 mL无菌磷酸缓冲液的50 mL离心管中，充分振荡。重复此步骤2次，获得稀释1000倍土壤悬液。悬液摇匀后，每孔125 μL依次加至Biolog Eco平板（每个土壤样本设置3次重复），后于28℃培养箱培养。每24 h于酶标仪（Varioskan Flash，芬兰）测定OD595和OD750，连续测定8 d。
1.5 数据处理及统计分析
使用Shannon-Wiener指数（H′）表示底物利用多样性，利用平均每孔吸光度（average well color development，AWCD）反映土壤微生物的总体代谢活性。计算公式分别为：
式中：C为每个底物的OD595值，R为板内控制孔的OD595值。Pi为平板中每个底物去除背景后（C-R）的校正OD595除以所有底物校正OD595值的总和。Pearson相关性分析及回归分析均在SPSS中完成；
变差分解分析（variance partitioning analysis）和Mantel test在R中完成［12-13］。
2.1 长期单作对枸杞园表层和亚表层土壤微生物底物利用的影响
Pearson相关性分析结果表明，随种植年限增加，枸杞园表层土壤微生物对吐温80（r=0.462，P=0.035）和衣康酸（r=0.434，P=0.050）的利用率显著增加；
而亚表层土壤对D-葡萄氨酸（r=-0.560，P=0.008）和苯乙基胺（r=-0.510，P=0.019）的利用率显著降低（表1）。
表1 枸杞园土壤微生物不同碳源利用率与种植年限的相关性Table 1 Pearson’s correlation between stand age and the utilization rates of different carbon sources of soil microorganisms in L.barbarum fields
将31种碳源按照氨基化合物、氨基酸、糖类、羧酸、双亲化合物和聚合物6类进行分析，发现枸杞园2个土层土壤微生物对聚合物的利用率均随种植年限增加显著降低（P＜0.05），其他5类底物的代谢活性无明显变化（图1）。对比不同深度土壤发现，亚表层土壤对聚合物的利用能力较表层土壤下降更加明显（图1F）。这些结果说明长期单作会导致枸杞园土壤微生物对聚合物的利用能力下降，且对亚表层土壤的影响较表层更加明显。
图1 长期单作对枸杞园土壤微生物6类碳源利用活性的影响Fig.1 Effects of long-term monocropping on utilization rate of different carbon groups of the soil microorganisms in L.barbarum fields
2.2 长期单作对枸杞园表层和亚表层土壤微生物底物利用多样性的影响
Biolog Eco平板分析表明，表层土壤微生物AWCD值随种植年限增长（R2=0.359，P=0.002），而亚表层AWCD值则与种植年限无明显关系（图2A）。此外，表层和亚表层土壤微生物底物利用谱的多样性指数均不受种植年限影响（图2B）。主坐标分析发现，枸杞园表层土壤微生物底物利用谱随种植年限增加无明显模式（图2C），但亚表层微生物底物利用谱随树龄增加逐渐趋同，且不同采样地点的变化趋势不同（图2D）。
图2 枸杞园土壤微生物底物利用多样性分析Fig.2 Analysis of metabolic activity and diversity of soil microbes in distinct soil depths of L.barbarum fields
2.3 长期单作下枸杞园土壤理化因子与微生物底物利用活性的关系
相关分析显示，长期单作条件下枸杞园土壤微生物底物利用香农指数和AWCD与土壤深度呈显著负相关（P＜0.05），而与全磷、沙粒含量、土壤脱氢酶及蛋白酶活性呈显著正相关（P＜0.05，图3）。此外，多数土壤酶活性，如蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和脱氢酶活性与土壤总有机碳、全氮、速效钾及电导率等呈负相关，表明长期单作可能影响枸杞园土壤微生物的代谢活性和物质循环功能。
图3 枸杞园土壤微生物特征、理化性质及土壤酶活性的相关性分析Fig.3 Correlation analysis among soil microbial characters，abiotic properties，and soil enzyme activities
变差分解分析（variance partitioning analysis）显示，土壤理化性质和微生物特征分别解释了枸杞园土壤微生物底物利用谱变化的6.7%和3.5%（P＜0.05，n=42，图4A），但这些因子不能解释表层土壤微生物底物利用谱的变化（P＞0.05，n=21，图4B）。对亚表层土壤的分析发现，土壤微生物特征是解释代谢谱变化的主要因子（R2=0.10，P＜0.05，n=21），而土壤理化性质和酶活性均对其无明显影响（P＞0.05，图4C）。
图4 变差分解分析枸杞园土壤微生物底物利用谱变化的主要解释因子Fig.4 Analysis of the explanatory factors for the shift in soil microbial substrate utilization profile of L.barbarum fields using variance partitioning analysis
Mantel test结果进一步显示，所有样本中，土壤微生物底物利用谱与土壤理化性质（r=0.265，P=0.001）、微生物特征（r=0.214，P=0.013）和真菌群落结构（r=0.140，P=0.038）呈显著相关关系（表2）。表层土壤底物利用谱仅与土壤理化性质呈弱相关关系（r=0.181，P=0.081），而亚表层土壤微生物底物利用谱与土壤理化性质（r=0.287，P=0.001）显著相关、与土壤真菌群落组成弱相关（r=0.125，P=0.114）。
表2 Mantel test分析土壤微生物底物利用谱与土壤理化性质、酶活性及微生物群落组成间的关系Table 2 Mantel test detects the relationships between soil microbial community-level physiological profiles and soil abiotic property，enzyme activity，and soil microbial community composition in L.barbarum fields
3.1 长期单作干扰枸杞园土壤微生物群落对复杂有机物的降解
前期研究结果发现，长期单作能够显著促进枸杞园表层和亚表层土壤有机碳、氮、磷及可利用磷含量积累［6，12］。这些营养物质的积累激活了表层土壤中蛋白酶、磷酸酶和脱氢酶等酶的活性［12］，同时促进了表层土壤微生物对碳源的利用活性，说明长期单作能够提高枸杞地表层土壤微生物的代谢活性。然而，本研究进一步发现长期单作抑制了枸杞园土壤微生物对聚合物的利用率（图1F）。虽然表层土壤AWCD值随种植年限增加逐渐升高，但这种激发效应主要是通过刺激土壤微生物群落对简单有机物的代谢活性而实现（图1）。这些结果暗示，长期单作可能导致枸杞园土壤微生物的代谢功能出现缺陷，诱使土壤微生物倾向于利用易分解有机物，进而影响土壤微生物对复杂有机物的分解和利用，最终诱发自毒作用。此外，这种作用可能与单作驱动的土壤生物群落变异和多样性减低［12］，尤其是真菌群落结构组成的变化有关（表2），但这一假设仍需进一步研究。
3.2 土壤理化性质和微生物群落部分驱动土壤微生物代谢活性
由于表层土壤经常受到旋耕、除草等机械干扰，且外界环境温度、蒸腾速率变化较大，从而导致影响表层土壤微生物代谢和多样性的因素较多（图2C）。与此同时，由于土壤微生物活性更容易受到采样时土壤微环境的瞬时效应影响，因此导致本研究所测定的数据无法有效解释表层土壤微生物代谢多样性。然而，亚表层土壤由于不受旋耕影响，且土壤温度和含水量等相对稳定［25］，因此长期单作下不断输入的化肥和植物残体会对土壤微生物群落组成［12］和微生物底物利用谱产生一定的积累效应（图4）。这种效应不仅反映了长期单作驱动枸杞园亚表层土壤微生物群落结构和功能演替的规律，而且排除了部分非单作因素的干扰。由此推测，亚表层土壤微生物的变化规律可能更准确地反映了长期单作对枸杞园土壤微生物区系和功能的累积效应，表明研究亚表层土壤质量和健康状况变化对于揭示多年生植物连作障碍机制可能更加重要。
与表层土壤不同，亚表层土壤微生物底物利用谱部分受土壤微生物特征和土壤理化因子影响（表2），说明长期单作导致的土壤理化性质改变影响了微生物组成［12］和代谢多样性（图4）。然而，本研究所测定的土壤理化因子和酶活性对枸杞园土壤微生物代谢活性的解释率较低，推测土壤微生物底物代谢谱可能与土壤活菌组成和多样性以及长期输入碳源的质和量有关。这一假设由亚表层土壤真菌绝对丰度和丰富度指数对枸杞园土壤微生物底物利用谱的影响间接证实（图4），但同样需要深入研究。结合前期研究揭示的长期单作抑制亚表层土壤真菌丰度和细菌多样性的试验结果［12］，本研究结果进一步说明长期单作对枸杞园亚表层土壤真菌丰度和多样性的负面效应，可能间接影响了土壤微生物的代谢活性，尤其是对聚合物的利用能力。
3.3 长期单作诱导的枸杞-土壤负反馈作用可能在亚表层土壤更为严重
与前期对土壤酶活性的研究结果一致［12］，本研究进一步发现枸杞园亚表层土壤微生物的代谢活性不受种植年限影响（图2A）。在长期单作条件下，亚表层土壤碳、氮和磷等营养元素均随种植年限增加而大量积累［12］，然而这种积累并没有激活亚表层土壤微生物的总体代谢活性（图2A），暗示该层土壤微生物的代谢功能可能受到长期单作影响。这一假设也间接由相关性分析结果印证，即主要土壤酶活性与土壤碳、氮、钾含量以及电导率呈负相关关系（图3）。长期单作条件下，当施入的化学肥料无法被植物利用时，无机离子的大量积累会增加土壤渗透势和离子浓度［26］。由于亚表层土壤无机盐的积累明显高于表层土壤［12］，盐分的积累对土壤微生物造成渗透和离子胁迫，从而影响深层土壤微生物的代谢活性和功能［27-29］。此外，由于负责吸收功能的细根（直径＜2 mm）主要分布在亚表层土壤［30-31］，因此该层土壤的次生盐碱化能够同时影响枸杞生长和土壤微生物功能，造成更严重的枸杞-土壤负反馈作用。在未来，需通过详细的田间和室内盆栽试验验证这一假设。
本研究结果表明，长期单作可促进枸杞园表层土壤微生物的代谢活性，但也抑制其对聚合物的降解，推测长期单作可能诱导土壤微生物更倾向于利用简单有机物。随种植年限增加，亚表层土壤微生物底物利用谱逐渐趋同，这种变化部分受枸杞园土壤理化因子和真菌丰度影响。长期单作下，枸杞凋落物的输入和化肥的使用能够影响土壤微生物群落的代谢活性和特征。这种影响在亚表层土壤可能主要以负面效应为主，进一步强调了亚表层土壤质量对枸杞种植业可持续发展的重要性。
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