曹礼慧，刘丽娟，袁中文，高珊珊，冯森玲
（广州医科大学附属第三医院药学部广东省产科重大疾病重点实验室，广州 510150）
子宫内膜癌是女性常见的恶性肿瘤之一。近年来其发生率和病死率不断升高，发病原因尚未完全明确，治疗方法主要是手术和放化疗[1]。迷迭香酸是一种天然多功能酚酸类化合物，因1958年首次从迷迭香植物中分离提取而得名[2]。研究[3-4]表明，迷迭香酸具有多种药理活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎和抗菌等，对肝癌、卵巢癌、宫颈癌等均表现出明显的抑制作用。本研究通过数据库筛选出迷迭香酸的作用靶点，探索迷迭香酸治疗子宫内膜癌的作用靶点及其可能的作用机制，为后续开展分子生物学研究及动物实验提供理论基础。
1.1 迷迭香酸靶点的筛选
检索中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、比较毒理学数据库（CTD，https://ctdbase.org/）获取迷迭香酸的预测靶点信息，利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）对靶点进行标准化处理。去除重复后筛选得到迷迭香酸的靶点。
1.2 子宫内膜癌相关靶点的检索
以“endometrial carcinoma”“endometrial cancer”为检索词，通过GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）和DisGeNET数据库（http://www.disgenet.org/）获取子宫内膜癌的作用靶点。将所有靶点去重后得到子宫内膜癌的靶点。
1.3 迷迭香酸治疗子宫内膜癌的关键靶点网络构建
将“1.1”中迷迭香酸的预测靶点与“1.2”中子宫内膜癌的相关靶点取交集，得到迷迭香酸治疗子宫内膜癌的交集靶点。将交集靶点输入STRING 11.5在线数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）对靶点间蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）进行分析。物种选择“Homo sapiens”，其他参数保持默认设置，从而得到PPI可视化网络图。将PPI数据导入Cytoscape软件中，利用Cytoscape的CytoHubba中Maximal Clique Centrality（MCC）拓扑分析方法构建迷迭香酸治疗子宫内膜癌的关键靶点。
1.4 GO功能及KEGG通路富集分析
使用Metascape在线数据库对得到的潜在靶点进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。再根据P值排序进行可视化分析。
1.5 分子对接验证
使用RCSB PDB数据库（https://www1.rcsb.org/）下载迷迭香酸治疗子宫内膜癌靶点的PDB格式文件，并用PyMOL删除多余蛋白小分子和配体，再使用TCMSP平台（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）下载迷迭香酸有效化学成分的mol2软件文件。通过AutoDock中的AutoGrid和AutoDock两个程序，分别进行格点中相关能量的计算和构象搜索与评价，预测最佳的结合模式。
2.1 迷迭香酸的靶点预测
通过TCMSP可以得到迷迭香酸的药理和分子特性信息，见表1。从TCMSP和CTD中共获取迷迭香酸作用靶点76个，见表2。
表1 迷迭香酸的药理和分子特性
表2 迷迭香酸的靶点
2.2 子宫内膜癌相关靶点的检索
通过检索GeneCards和DisGeNET数据库共获得子宫内膜癌相关靶点4 052个。
2.3 迷迭香酸治疗子宫内膜癌的关键靶点
将迷迭香酸与子宫内膜癌的靶点取交集，共获得67个交集靶点。利用STRING 11.5在线数据库对靶点间蛋白相互作用进行分析，得到PPI可视化网络图，见图1A。将PPI数据导入Cytoscape软件中，获得前10个hub蛋白，由此推测JUN、TNF、IL-6、PTGS2、MMP-9、CASP3、AKT1、IL-1B、MAPK3、CCL2靶点可能为迷迭香酸治疗子宫内膜癌的关键靶点，见图1B。
图1 迷迭香酸治疗子宫内膜癌的集靶点
2.4 迷迭香酸治疗子宫内膜癌的GO生物学功能富集分析
GO富集分析共有条目1 422条，包括生物过程（biological process，BP）1 302条、细胞组成（cellular component，CC）44条和分子功能（molecular function，MF）76条。根据P值大小展示前10条GO条目，见表3、图2。根据结果显示，脂多糖反应、细菌来源分子反应、细菌反应、氧化应激反应、氧活性反应为最明显的生物过程，可能是迷迭香酸治疗子宫内膜癌潜在最重要的生物过程。
图2 GO富集分析柱状图
表3 GO富集分析结果
2.5 迷迭香酸治疗子宫内膜癌的KEGG通路富集分析
KEGG富集分析通路共271条。根据P值大小展示前20条通路，见表4。糖尿病并发症AGERAGE信号通路、查加斯病、IL-17信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路是最为显著的信号通路，可能是迷迭香酸治疗子宫内膜癌最重要的作用通路。其他通路还有百日咳、乙型肝炎等，气泡图见图3，KEGG靶点-通路见图4。
图3 KEGG富集分析气泡图
图4 KEGG靶点-通路网络
表4 KEGG富集分析结果
2.6 迷迭香酸与关键靶点的分子对接
对迷迭香酸与PPI拓扑异构分析结果中10个关键靶点进行分子对接验证。一般认为，配体与受体结合的构象越稳定时能量越低，结合作用越大，多数研究以结合能≤-5.0 kJ·mol-1（约为-1.2 kcal·mol-1）为筛选标准，当结合能≤-7.0 kJ·mol-1（约为-1.7 kcal·mol-1）时，结合作用更大。结果发现，迷迭香酸与10个关键靶点均具有较好的结合力，其中与MMP-9结合作用最大，其次是AKT1，验证了网络构建预测的准确性，说明MMP-9和AKT1可能是迷迭香酸治疗子宫内膜癌的潜在主要靶点，见表5。采用PyMOL软件对靶点蛋白与成分对接的最佳构象进行可视化分析，见图5。
图5 迷迭香酸与关键靶点的分子对接图
表5 迷迭香酸与关键靶点的分子对接
迷迭香酸治疗子宫内膜癌的10个关键靶点为JUN、TNF、IL-6、PTGS2、MMP-9、CASP3、AKT1、IL-1B、MAPK3、CCL2。其中，MMP-9即结合基质金属蛋白酶-9，在女性机体癌细胞侵袭与转移过程中发挥重要作用[5-6]，通过破坏细胞外基质结构，使癌细胞通过部分缺失的细胞外基质向周围组织浸润，造成癌细胞的侵袭与转移。子宫内膜癌中MMP-9的表达情况可以提示患者的子宫内膜癌恶性程度，MMP-9表达较高者，肿瘤恶性程度高，易于浸润转移，临床预后差[7-8]。AKT1是AKT的重要亚型之一，AKT能够通过磷酸化及其下游的多种作用底物促进肿瘤细胞的生长、增殖，抑制细胞凋亡，在多种肿瘤组织中都存在AKT的过度表达和活化[9]。研究[10]发现，AKT1可在人胃癌和乳腺癌中发生异常表达和活性改变，在子宫内膜癌中的表达量也较在正常组织中升高。结合本文的分子对接验证结果，似乎预测了迷迭香酸可通过抑制MMP-9和AKT1的表达进而治疗子宫内膜癌。
为了研究交集靶点的生物学功能和通路，本文进行了GO生物学功能富集分析和KEGG通路富集分析，主要涉及的重要通路有糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、查加斯病、IL-17信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路等。在这些通路中，IL-17信号通路能够增加癌细胞的恶性程度，其中IL-17A能够促进癌细胞的增殖，抑制凋亡，促进肿瘤迁移[11-12]，IL-17可以激活NFκB和MAPK通路，NF-κB和MAPK均是IL-17发挥其促炎症作用的靶基因，可促进肿瘤导致的炎性反应[13]。TNF信号通路是维持组织稳态和防止炎症病理的关键，与细胞的存活和凋亡相关，TNF是激活NF-κB的主要细胞因子，同时，TNF也能诱导细胞凋亡和坏死[14]。Toll样受体家族是一组结构高度保守的模式识别受体，通过识别病原体相关的分子模式启动机体产生免疫应答，抵御病原体入侵，能够通过直接和间接的方式影响调节性T细胞抑制免疫应答的功能[15-16]，Toll样受体2家族在子宫内膜癌中高表达，则提示患者恶性程度高，转移及复发概率大[17-18]。本研究为迷迭香酸治疗子宫内膜癌的潜在可行性提供了依据。
综上所述，本研究利用数据库对迷迭香酸治疗子宫内膜癌的潜在靶点和作用通路进行挖掘，发现迷迭香酸可能具有治疗子宫内膜癌的潜在价值，为后续实验提供了思路和依据。
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