叶玉珍，钟志娟，李 馨，钟富丹，黄钰涵，毛露甜，徐良雄*
（1.惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007；
2.华南农业大学 生命科学学院，广东 广州 510642）
细菌种类丰富，广泛分布于自然界，有的细菌会导致植物病害，如青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）可在200多种植物中引发致命的“青枯病”［1］和由黑胫病菌（胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种，Erwiniacarotovora subsp.atroseptica）引起马铃薯黑胫病可使植株根部变黑腐烂［2］，严重影响作物的产量，造成农作物的经济效益下降。而金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）可致使人类患病，危及人类的生命健康［3］。抗生素在应对各类植物细菌病害、动物及人类细菌感染中发挥着十分重要的作用。然而，农业、畜牧业及医疗领域中抗生素的大量使用和排放可造成环境长期残留，进一步加速了细菌耐药性的发生与扩散，给农业病害防治与细菌感染临床治疗带来了严峻挑战，新型抗生素的发现意义重大［4-5］。
植物内生真菌资源丰富，其次生代谢物种类多样、产物化学结构独特、不少具有良好的抗菌活性，是发现新型抗生素的重要资源［6-7］。在前期抗菌活性植物内生真菌的筛选中，已发现分离自银叶树的一株内生黑孢菌HU0460，其玉米发酵物具有明显的金黄色葡萄球菌拮抗活性，并从中发现了4个蒽醌类化合物，本研究将对其制备、鉴定过程和抗菌活性进行报道。
1.1 实验材料
黑孢菌Nigrosporasp.HU0460 于2018 年3 月分离自汕尾市海丰县附近的银叶树Heritiera littoralisDryand枝条，保藏于实验室；
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）、大肠杆菌（Escherichia coli）购于广东省微生物菌种保藏中心；
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin resistantS.aureus，MRSA）由广州呼吸疾病研究所呼吸疾病国家重点实验室提供；
青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、黑胫病菌（Erwinia carotovora subsp.atroseptica）由实验室分离鉴定。
1.2 仪器与试剂
提取及分离所用试剂均为分析纯（天津大茂）；
硫酸链霉素和甲氧西林（上海麦克林生化科技），万古霉素（上海宏叶生物科技）；
柱层析硅胶（74~150μm，烟台江友硅胶）；
Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶（瑞典Amersham Biosciences）；
LC-16P 高效液相色谱仪和LC-MS-8040 电喷雾质谱仪（日本Shimadzu），Lambda紫外分光光度计（美国PerkinElmer），Synergy H1 多功能微孔板检测仪（美国BioTek），Quantum-I核磁共振波谱仪（400 MHz，武汉中科牛津），Bio TOF IIIQ高分辨质谱仪（德国Bruker），IP-digi300/3+旋光仪（上海仪迈仪器）。
1.3 菌株发酵
将活化好的菌块接种至30 mL PDB 中，28 ℃振荡培养3 d 得到1 级种子液；
吸取2 mL 菌液至装有120 mL PDB 的三角瓶内，相同条件下培养3 d，得到2级种子液；
分别吸取5 mL 菌液均匀接种至150 瓶玉米固体培养基中，28 ℃黑暗静置培养35 d。
1.4 发酵物提取与分离
发酵物以95%乙醇浸提3 次，提取液过滤后浓缩除去乙醇得到混悬液。混悬液以乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯部，该部经正相硅胶（74~150μm）柱层析，以二氯甲烷-甲醇（100∶0~80∶20）梯度洗脱得到流份E1~22。合并流份E10（15.0 g）经中压反相硅胶柱层析，30%~100%甲醇—水梯度洗脱得到E10-1~12，其中E10-4 为化合物3（355.0 mg）。流份E10-11（1.0 g）经凝胶柱层析，纯甲醇溶液等度洗脱得到流份E10-11-1~6，流份E10-11-4（193.0 mg）经大孔吸附树脂柱层析，20%~80%甲醇水溶液梯度洗脱得到化合物4（161.0 mg）。E12（2.0 g）经中压反相硅胶柱层析，30%~80%甲醇-水梯度洗脱得到E12-5-1~14，流份E12-5-10 经HPLC 制备纯化，30%甲醇—水等度洗脱得到化合物1（15.5 mg，tR= 30.4 min）和化合物2（6.5 mg，tR=41.2 min）。
1.5 化合物结构鉴定
通过综合分析核磁共振谱、质谱数据，结合文献鉴定化合物1~4的化学结构如图1所示。
图1 化合物1~4的化学结构
1.6 化合物活性评价
采用滤纸片琼脂扩散法［8］与微量稀释法［9］评价单体化合物的细菌拮抗活性，甲氧西林、万古霉素与硫酸链霉素为阳性对照。滤纸片琼脂扩散法中，阳性对照载样量为40µg），化合物载样量为100 µg，设置3 组重复，结果取其平均值。
2.1 化合物结构鉴定
化合物1：淡粉色固体粉末，ESI-MS：m/z355［M+H］+，353［M - H］-，707［2M - H］-，［α］24D= - 6.0（c0.1，CH3OH）;UV（CH3OH）λmax（log ε）212（2.45），236（2.66），290（3.58），366（3.43）nm。通过HRESIMS 显示的准分子离子峰m/z355.138 63［M+H］+（理论值为355.139 29），推断其分子式为C17H22O8。1H NMR 谱（表1）显示化合物1 存在1 个不饱和碳上质子［δH6.51（s，1H），H-6］和4 个疑似连氧碳上质子信号［δH4.66（d，J = 2.8 Hz，1H，H-9）；
3.83（dd，J = 10.2，5.3 Hz，1H，H-4）；
3.46（overlapped，1H，H-4a）；
3.33（overlapped，1H，H-3）］和2 个甲氧基［δH3.96（s，3H）;δH3.45（s，3H）］和1 个甲基［δH1.18（s，3H）］质子信号。13C NMR谱显示该化合物共有17个碳信号，其中：包括1 个羰基（δC207.58）、6 个芳香环碳（δC160.77，158.30，139.76，124.03，109.24，100.61）、6个连氧碳［δC77.42，74.70，73.95，72.96，57.35，56.86］和其余5 个碳［δC45.87~27.35］信号。
表1 化合物1的1H NMR和13C NMR数据（溶剂为氘代甲醇）
通过1H-1H COSY、HSQC和HMBC谱（图2）分析对上述质子信号和碳信号进行归属，发现其与另一个蒽醌类化合物4a-epi-9α-methoxydihydrodeoxybostrycin［10］（2）具有类似的结构骨架。但化合物1 中的C-4位为一个连氧碳［δH3.83（dd，J=10.2，5.3 Hz，1H，H-4）；
δC74.70］，而非亚甲基。在NOESY谱，H-1a和H-1α（δ 1.55）、H-4、H-4a 相关，说明它们在空间上相互靠近，H-1a和H-4、H-4a位于该六元环的同侧，C-4位的羟基处于β-位；
H-3与H-1β（δ 1.09）、H-3、H-11相关，提示C-2 和C-3 位的羟基处于α-位。此外，其JH-9/H-1a、JH-1a/H-4a与4a-epi-9α-methoxydihydrodeoxybostrycin（2）一致，后者的绝对构型通过X-单晶衍射得到了确认［10］，因此推定化合物1的绝对构型为1aS，2S，3R，4S，4aS，9R，该新蒽醌类化合物命名为4a-epi-4β，9α-dimethoxydihydrodeoxybostrycin。
图2 化合物1的1H-1H COSY（粗线）和HMBC（箭头）相关
化合物2：淡粉色固体粉末，ESI-MS：m/z337［MH］-，［α］24D=-12.5（c0.07，CH3OH）;UV（CH3OH）λmax（logε）211（2.36），244（2.11），289（2.73），357（3.55）nm。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ6.49（s，1H，H-6），4.65（d，J=2.8 Hz，1H，H-9），3.94（s，3H，H-12），3.43（s，3H，H-13），3.17（dd，J= 12.0，4.3 Hz，1H，H-3），3.13（m，1H，H-4a），2.87（m，1H，H-1a），2.60（ddd，J=12.6，4.3，2.5 Hz，1H，H-4α），1.75（td，J=12.6，5.3 Hz，1H，H-4β），1.56（ddd，J= 13.7，3.1，1.6 Hz，1H，H-1α），1.13（s，3H，H-11），1.00（t，J= 13.7 Hz，1H，H-1β）;13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ204.79（C-10），160.05（C-5），157.28（C-7），139.33（C-8），124.77（C-9a），109.06（C-10a），100.41（C-6），74.47（C-9），72.95（C-3），71.85（C-2），57.23（C-13），56.72（C-12），42.32（C-4a），39.55（C-1），36.32（C-1a），29.40（C-4），27.29（C-11）。对比文献［10］，化合物2被鉴定为4a-epi-9α-methoxydihydrodeoxybostrycin。
化合物3：黄色固体粉末，ESI-MS：m/z339［MH］-，［α］28D=-85.3（c0.15，CH3OH）;UV（CH3OH）λmax（log ε）214（2.83），244（2.69），284（3.52），355（3.62）nm。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ6.49（s，1H，H-6），4.82（d，J= 9.8 Hz，1H，H-9），4.09（t，J= 9.2 Hz，1H，H-4），3.92（s，3H，H-12），3.28（d，J = 9.2 Hz，1H，H-3），2.40（td，J=13.2，9.2 Hz，1H，H-4a），2.35（m，1H，H-1β），2.30（m，1H，H-1a），1.44（dd，J= 13.6，11.4 Hz，1H，H-1α），1.33（s，3H，H-11）;13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ205.11（C-10），159.86（C-5），157.48（C-7），138.83（C-8），128.76（C-9a），109.40（C-10a），100.14（C-6），79.40（C-3），73.37（C-9），72.08（C-4），72.06（C-2），56.71（C-12），53.25（C-4a），41.06（C-1），40.74（C-1a），27.20（C-11）。比对文献［10-11］化合物3鉴定为9α-hydroxyhalorosellinia A。
化合物4：棕红色固体粉末，ESI-MS：m/z335［MH］-，［α］24D=- 87.8（c 0.1，CH3OH）; UV（CH3OH）λmax（log ε）212（2.97），254（2.97），299（3.46），501（3.39）nm。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ6.44（s，1H，H-6），4.73（d，J=4.5 Hz，1H，H-4），3.89（s，3H，H-12），3.50（d，J=4.5 Hz，1H，H-3），2.71（d，J=18.2 Hz，1H，H-1α），2.65（d，J= 18.2 Hz，1H，H-1β），1.21（s，3H，H-11）;13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ184.91（C-5），178.12（C-8），161.12（C-10），160.70（C-7），160.66（C-9），139.85（C-4a），137.45（C-1a），110.36（C-6），110.36（C-9a），108.10（C-10a），76.90（C-3），69.88（C-2），68.85（C-4），57.44（C-12），35.47（C-1），26.21（C-11）。对比文献数据［10-11］，化合物4被鉴定为bostrycin。
2.2 化合物活性评价结果与分析
活性测试结果显示（表2），100 μg 载样量下，除大肠杆菌外，化合物1~4对其余4种测试菌均具有拮抗活性，其中化合物4的抗菌效果较好，其MRSA拮抗效果优于40 μg 的硫酸链霉素，黑胫病菌拮抗效果与40 μg的硫酸链霉素相当。MIC测定结果与滤纸片扩散法结果基本一致，其中化合物4对金黄色葡萄球菌、黑胫病菌和青枯病菌具有较好的细菌拮抗活性，其MIC 值分别为25、50、12.5 μg/mL。化合物3 对青枯病菌表现出较弱的抑制活性（MIC=100 μg/mL），以及化合物1 对黑胫病和青枯病菌具有微弱的抑制活性（MIC = 200 μg/mL），所有化合物对大肠杆菌均未表现出抑制活性（MIC ＞400 μg/mL）。
表2 化合物1~4对5种细菌的抑菌活性
在活性追踪的指导下，本研究从银叶树内生黑孢菌HU0460 玉米发酵物中分离鉴定了1 个新蒽醌类化合物4a-epi-4β，9α-dimethoxydihydrodeoxybostrycin（1）和3 个已知蒽醌类化合物4a-epi-9α-methoxydihydrodeoxybostrycin（2）、9α-hydroxyhalorosellinia A（3）和bostrycin（4）。其中，化合物4 得率高，且对金黄色葡萄球菌、黑胫病菌和青枯病菌的抗菌活性较强，其余3个化合物对上述测试菌表现出较弱的抑制活性。
黑孢属真菌可产生如环肽类、萜类、甾体类和蒽醌类化合物等多种类型的代谢物，其中部分代谢产物具有不同的细菌拮抗活性［12］。UKWATTA［13］等从红树林植物内生菌N.sphaerica中分离得到的苯基萘化合物nigronapthaphenyl，对枯草芽孢杆菌具有较强的抑制活性，MIC 值为2 μg/mL。TRISUWAN［14］等从Nigrospora sp.PSU-F18 分离得到的吡酮衍生物nigrosporapyrone A 其对金黄色葡萄球菌和MRSA 均有一定抑制活性。WANG［15］等研究发现红树林植物内生菌Nigrospora sp.的蒽醌化合物4-deoxybostrycin 和nigrosporin B具有显著的抑制结核分枝杆菌活性。除黑孢菌可产生蒽醌bostrycin［16］外，bostrycin 在镰刀菌属真菌的发酵物中也有报道［17］。bostrycin 不仅具有广谱抗肿瘤活性，还是潜在的抗肿瘤药物候选药物［18］，同时对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌也具有较强的细菌拮抗活性，MIC 值分别为0.26 μg/mL 和4.2 μg/mL，并且发现其乙酰基衍生物具有更强的抑制活性［10］。本研究发现Nigrosporasp.HU0460 玉米发酵物中bostrycin 得率较高，约占发酵物乙酸乙酯部分的1.4%，且对MRSA和革兰氏阴性菌（青枯病菌和黑胫病菌）均具有良好的抑制活性。
本研究初步探讨了黑孢菌HU0460 的抗菌活性物质基础，发现了4个蒽醌类化合物，丰富了黑孢菌次级代谢产物多样性，为该菌抗菌成分的深入研究奠定了基础，对新型微生物源抗菌剂的研发具有一定的参考价值。
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