朱 怡，李 毅，东贵荣
心肌梗死是最严重的心血管疾病之一，是我国乃至全球重要的公共卫生问题，也是我国居民死亡的第二大病因[1]。随着经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)的普及，心肌梗死病人的死亡率逐渐下降。PCI术能够有效恢复梗死心肌的血液供应，减少心肌梗死面积，改善心脏功能，但同时缺血部位的心肌重新获得血流供应后，常会产生不可逆的二次损伤，称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)，这些损伤可以引起严重的并发症，如梗死面积增大、心室收缩功能降低、心律失常等，从而降低病人生存率[2]。因此，MIRI具有一定的危险性，如何预防或减少这种损伤，提高病人的生存质量，改善预后，是目前面临的巨大考验。现代医学对MIRI的防治多采取缺血预处理及药物干预等，但目前尚无定论。本研究通过探究电针内关穴预处理对冠心病PCI术病人心脏相关指标的影响，从临床上证实电针预处理对防治MIRI的作用，以及探讨可能的作用机制。
1.1 临床资料 选取2017年12月—2018年12月在上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院心内科确诊为冠心病并择期行PCI术的病人为候选受试对象，所有入选者均办理常规入院，完成心内科常规入院检查，按照排除标准排除部分病人，在入组试验前告知病人本课题具体研究内容及相关可能的受益和风险，在取得病人、家属的同意后，签署知情同意书，最后纳入病人60例，按照随机数字表法分为电针预处理组和对照组(control group，CG)。本研究符合《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》《赫尔辛基宣言》和《人体生物医学研究国际道德指南》的伦理原则，经上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院伦理委员会审查并批准，批号为2017-029。受试者了解本临床试验并自愿签署知情同意书。
1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①确诊为冠心病，年龄18～74岁；
②纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级Ⅰ～Ⅲ级；
③拟行PCI术；
④有能力履行知情同意手续，并签署知情同意书。排除标准：①急诊PCI病人；
②非首次PCI术病人；
③伴有严重的其他相关疾病(预期生存时间<12个月)；
④精神障碍、意识障碍、行为障碍等不能合作者；
⑤所需电针区域有皮肤过敏、破损等功能障碍者；
⑥拒绝加入本研究者。中止或撤出标准：①未植入支架病人；
②试验中电针后出现晕针等相关针刺不良反应；
③试验中发生严重安全性问题；
④试验中发现临床试验方案操作失误，难以评价针刺效果；
⑤试验管理原因。如符合下列任意1项即应剔除，不计入各观察指标的评价：①未执行本试验方案规定的受试者；
②观察项目不全且不能评价试验效果及副反应的受试者。
1.3 治疗方法 两组病人均接受常规心内科药物治疗，本次试验除电针预处理组行电针预处理外，不进行其他任何干预。
1.3.1 电针预处理组 术前1 h，嘱病人取卧位或坐位，手臂内侧面朝上，对电针预处理组病人的双侧内关穴和大陵穴进行电针预刺激。定位：大陵穴在腕横纹中央，内关在腕横纹上2寸，掌长肌腱与桡侧腕屈肌腱之间。操作：将病人电针预处理处的皮肤用乙醇棉球擦拭，待残留乙醇干燥后，针刺病人双侧内关穴、大陵穴，根据病人体型，针刺深度为0.5～1.0寸，采用平补平泻法，连接低频脉冲治疗仪进行电针刺激30 min，内关穴接负极，大陵穴接正极，采用疏密波(疏波2 Hz，密波30 Hz)，电流强度以病人能耐受最大电流为适宜。电针治疗结束后于我院数字减影血管造影(DSA)室行PCI治疗。
1.3.2 对照组 不进行电针预处理。
1.4 相关检测试剂及仪器
1.4.1 主要化学试剂 Trizol(invitrogen 1596-026)、DEPC处理水[基尔顿生物科技(上海)有限公司，R1600]、Ficoll液[基尔顿生物科技(上海)有限公司，R1603]、人淋巴细胞分离液(Solarbio P8610)、SYBR Green PCR 试剂盒(Thermo #K0223)、逆转录试剂盒(Fermentas #K1622)等。
1.4.2 主要实验仪器 低频脉冲治疗仪(上海医疗器械技术公司，G6805-2型)、电动匀浆机(FLUKO PRO200)、低温冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司，TG-16M)、旋涡振荡器(青浦沪西仪器厂，K30)、Real-time检测仪(ABI公司，ABI-7500)等。
1.5 观察指标
1.5.1 心肌损伤相关指标 取电针预处理组病人和对照组病人术前和术后24 h静脉血5 mL，常温保存，离心后冷冻保存。酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组治疗前后血清肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)浓度变化，所有试剂盒均购自美国R&D公司，检测由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院检验科医师严格按试剂说明书执行。
1.5.2 炎症相关指标 取电针预处理组病人和对照组病人术前和术后24 h静脉血5 mL，离心管中加入单核细胞分离液Ficoll液，离心后收集淋巴细胞并置于1.5 mL离心管中，冷冻保存，实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测病人治疗前后外周血单核细胞Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)及核转录因子-κB(NF-κB)mRNA的表达。①外周血单核细胞分离。取抗凝血，用等体积磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释全血；
在 15 mL离心管中加入5 mL单核细胞分离液Ficoll液，用巴氏吸管吸取等体积的稀释后全血，小心加在分离液上，平铺于分离液上层；
2 000 r/min室温离心20 min；
观察出现明显分层，最上层为稀释的血浆层，中间为透明的分离液层，血浆与分离液间的白膜层即为单核细胞层，下层为红细胞和粒细胞，小心吸取白膜层细胞至15 mL离心管中，加入10 mL PBS液，用细胞冻存液重悬细胞，1 500 r/min离心10 min，弃上清，重复上述操作2次；
收集淋巴细胞置于1.5 mL离心管中，用于总RNA提取。②cDNA 第一条链的合成。总RNA中DNA的消除：按以下体系加入，DNaseI 1 μL；
10×DNaseI Buffer 1 μL；
总RNA≤1 ng；
DEPC-H2O 4 μL；
总体积10 μL。反应条件为37 ℃、30 min；
加1 μL乙二胺四乙酸(EDTA)；
65 ℃、10 min。RNA逆转录：将提取的总RNA逆转录为cDNA，反应条件为37 ℃、60 min，85 ℃、5 min，4 ℃、5 min，体系为RNA-Primer Mix 12 μL、5×RT Reaction Buffer 5 μL、25 mmol/L dNTPs 1 μL、25 U/μL RNase Inhibitor 1 μL、200 U/μL M-MLV Rtase 1 μL和ddH2O(DNase-free)4 μL。③RT-PCR扩增：按照聚合酶链式反应(PCR)扩增试剂盒说明书扩增靶基因和内参基因，反应条件为95 ℃、10 min(95 ℃、15 s，60 ℃、45 s)×40；
95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s；
反应体系为SYBRGreen Mix 12.5 μL，正向引物0.5 μL，反向引物 0.5 μL，ddH2O 9.5 μL和cDNA模板2 μL。数据采用仪器自带软件ABI Prism 7500 SDS Software进行分析。引物序列见表 1。④基因相对表达量的计算。通过目的基因与内参基因的扩增动力学曲线确定扩增效率，采用比较Ct值法对样品的扩增Ct值进行计算，带入计算公式求出基因相对表达量。
表1 引物序列
2.1 一般情况 入组病人共60例，因特殊原因脱落3例(2例因手术取消，1例签署知情同意书后拒绝参加试验)，故最终纳入试验57例。电针预处理组28例，男17例，女11例，年龄(64.61±6.30)岁；
对照组29例，男17例，女12例，年龄(61.38±7.70)岁。两组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.2 两组血清cTnI、CK、CK-MB浓度比较 电针预处理组术前和术后血清cTnI比较，差异无统计学意义(P>0.05)。对照组PCI术后cTnI有升高趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。电针预处理组术前和术后血清CK浓度比较，差异有统计学意义(P<0.05)，电针预处理能降低PCI术后病人血清CK浓度；
对照组术前与术后CK浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)；
虽然两组PCI术前后CK浓度差值比较差异无统计学意义(P>0.05)，但电针预处理能抑制PCI术后病人CK浓度升高。电针预处理组与对照组术后血清CK-MB表达均有一定程度降低，术前与术后比较差异有统计学意义(P<0.05)，两组PCI术前后CK-MB浓度差值比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2、表3。
表2 两组cTnI、CK、CK-MB浓度比较[M(Q1，Q3)] 单位：ng/mL
表3 两组cTnI、CK、CK-MB术前与术后差值比较[M(Q1，Q3)] 单位：ng/mL
2.3 两组外周血单核细胞中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA表达比较 两组治疗前外周血单核细胞TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA的表达比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)，电针预处理组和对照组术后外周血单核细胞TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA均上升，PCI术前后对比差异均有统计学意义(P<0.001)；
但电针预处理组TLR4 mRNA术前与术后差值与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；
电针预处理能有效降低PCI病人外周血单核细胞MyD88 mRNA、NF-κB mRNA的表达，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4、表5。
表4 两组外周血单核细胞TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA表达比较(±s)
表5 两组外周血单核细胞TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA术前与术后差值比较(±s)
随着社会现代化进程的加快、生活方式的改变、人口老龄化趋势等诸多因素，心血管疾病的发生率逐年升高，我国心血管疾病患病率处于持续上升阶段，根据2019年出版的《中国心血管健康与疾病报告》推算，我国心血管病现患病人数达3.3亿例，2017年心血管病死亡率仍居首位，高于肿瘤及其他疾病，而心肌梗死是最严重的心血管疾病之一，随着医学的不断发展，PCI术被广泛应用于心肌梗死的临床治疗，但近年来的实验室与临床研究不断证明，PCI术作为一种针对心肌梗死的有效治疗措施也会导致MIRI[3-4]。MIRI是心肌组织在缺血恢复血流供应后，在各种原因和机制共同作用下，心肌组织发生结构损伤、代谢异常及功能障碍等，引起梗死面积增大、心律失常、心室重构及心力衰竭等严重并发症，直接影响病人预后，降低病人生存率[5]，因此，如何减少或者避免MIRI是目前亟须解决的热点问题。
MIRI发生机制较为复杂，细胞内钙超载[6-7]、氧自由基暴发[8]、细胞凋亡[9-10]、细胞自噬[11-14]和细胞坏死[15-16]、炎症[17-19]等因素是MIRI发生和发展的重要原因，各损伤因素之间相互作用，共同导致了心肌细胞结构和功能的损伤。其中，与先天免疫及炎症反应密切相关的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路被证实影响着心室重构和心脏功能，在MIRI中起重要作用[20-22]，研究显示，MIRI大鼠心肌细胞中TLR4、MyD88及NF-κB表达增高，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路能提高炎症反应，影响缺血心肌功能的恢复，削弱或抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路能减轻MIRI程度[23-24]。cTnI是判定MIRI的一个敏感且高度特异性的指标，当心肌细胞受损伤时，游离的cTnI释放入血液，随着损伤的加重，结合部分的cTnI也释放入血液，因此，病人cTnI会持续增高[25-26]；
CK较多存在于骨骼肌、平滑肌和心肌细胞的细胞质和线粒体中，与细胞内能量转运、三磷酸腺苷(ATP)再生和肌肉收缩密切相关，急性心肌梗死病人血清中CK含量增高；
CK-MB也会释放入血，CK-MB仅存在于心肌细胞中，因此，检测血清中CK和CK-MB的含量可作为判断心肌细胞损伤的重要辅助手段[27-28]。
既往研究证实，电针内关穴可以通过降低钙离子超载、减少心肌细胞凋亡、抗氧化应激反应、抗炎等多种机制，有效保护心肌，改善心脏功能。本研究结果显示，PCI术后病人血清cTnI、CK及外周血单核细胞TLR4、MyD88 和 NF-κB mRNA表达均有一定程度的升高，说明 PCI术后病人在一定程度上发生了MIRI；
电针内关穴预处理能有效抑制PCI术后病人血清 cTnI和CK浓度。说明电针内关穴能保护MIRI心肌；
并且电针预处理能有效降低外周血单核细胞MyD88、NF-κB mRNA表达，以及对TLR4 mRNA表达也有一定的抑制作用，以上均说明电针内关穴预处理能有效抑制PCI术后病人发生MIRI的程度，预防MIRI，其作用机制可能与TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。
在以往关于内关穴改善MIRI的研究中，多以实验研究为主，通过本次临床观察研究，从临床上进一步证实了电针预处理内关穴对冠心病行PCI术病人心肌有保护作用，这为今后在临床上如何有效地预防MIRI，提高冠心病行PCI术病人的临床预后，提供了新思路。本试验缺少术后长期随访，尚未跟踪记录病人心脏超声、心力衰竭发生率、生存率等指标，将在今后进行进一步深入研究。
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