温国琴
（朔州师范高等专科学校，山西 朔州 036002）
苦荞具有很丰富的营养物质，对于提高体质有好处，可以起到预防心血管疾病的作用，很适合中老年人食用，对于保健养生有很好的作用。在加工处理后，可以从苦荞麸皮中提取苦荞蛋白物质[1]。苦荞富含多种人体所需营养成分，并因其天然属性成为人们喜爱的保健产品[2]。
在苦荞蛋白提取过程中，一般采用酶解的方式。与苦荞蛋白相比，苦荞生物活性肽在生理保健功能上表现出更加突出的效果[3]。相关专家对于酶解法获得苦荞生物活性肽的相关研究逐渐增加，酶解法获得苦荞生物活性肽成为苦荞蛋白水解技术发展的主要方向[4]。从生物学角度分析，苦荞生物活性肽（bioactive peptides）作为一种蛋白水解产物，是苦荞蛋白降解之后形成的。借助不同类型的蛋白酶对其进行水解[5]，可以产生对应的肽类混合物并具有生物学活性特征[6]。从构成角度分析，苦荞生物活性肽的氨基酸组成与苦荞蛋白基本一致，但经酶水解后，人体更容易消化和吸收[7]。
酶水解苦荞产物具有巨大的开发利用价值[8]。值得注意的是，酶水解苦荞产物的活性是关系其功能的重要因素。开展碱性蛋白酶水解苦荞的抗氧化活性研究，分析不同条件下苦荞生物活性肽的活性，以期为苦荞生物活性肽的提取提供有价值的参考，助力碱性蛋白酶水解苦荞的营养价值得到最大限度的利用。
1.1 材料与试剂准备
开展试验测试的主要试剂材料为苦荞粉和碱性蛋白酶。苦荞粉为西荞2 号，蛋白质含量为74.5%。碱性蛋白酶为2709 碱性蛋白酶[9]，具体参数为2.4 AU/g。除上述材料外，在试验过程中使用到的其他试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器与设备准备
考虑到对苦荞蛋白进行酶水解需要执行的操作步骤，使用的仪器及主要参数信息如表1 所示。
表1 仪器参数信息
1.3 试剂配制
需要配制的试剂为苦荞蛋白溶液，在完成制备后，对其进行纯度测定。按照1∶5 的料液比将苦荞全粉与石油醚充分混合，利用顶置式搅拌器，在常温状态下搅拌24 h。执行该过程的主要目的是对苦荞全粉进行脱脂，确保最终配制苦荞蛋白的纯度。在24 h 后，利用双层滤纸对配制的溶液进行过滤，之后再进行1 次脱脂处理，操作方式与第一次完全一致。需要注意的是，脱脂后苦荞全粉需要置于通风橱内进行完全干燥，干燥时间为12 h。
对于得到脱脂苦荞全粉，按照料液比1∶10 的比例进行配制，配制溶剂为去离子水。充分混合后，利用pH 计读取酸度值，当酸碱度低于8.0 时，用4.0%的NaOH 溶液，采用逐滴滴定的方式，将pH 值调节至8.0，之后放置在顶置式搅拌器中常温搅拌2 h。之后，将配制的苦荞全粉悬浊液在离心机中进行离心处理，设置转速为5 500 r/min，离心20 min 后，收集离心管中的上清液。对于离心管中的沉淀，重复执行与去离子水的混合操作，调节pH 值至8.0，复提1 次。将两次提取到的上清液合并。由于蛋白等电点pH 值为4.5，因此需要将上清液pH 值调整为4.5。再次离心，收集离心管底部的沉淀，冷冻保存，即为苦荞冻干粉。与去离子水复溶并调节pH 值至7.0，即可得到苦荞蛋白溶液。
2.1 试验参数
按照3.0%的标准，利用去离子水配制苦荞蛋白溶液。分别调节溶液的pH 值、温度以及2709 碱性蛋白酶，酶解反应完成后，将溶液置于磁力水浴锅中，设置温度为100 ℃，灭酶10 min 后，冷却至室温。在离心机上按照6 000 r/min 的转速离心10 min，此时离心管中的清液即为苦荞蛋白水解产物，对其活性指标进行检测。试验因素包括温度、pH 值、2709 碱性蛋白酶的使用量以及水解时间，具体设置如表2 所示。按照表2 参数进行单因素影响测试，结果如图1～图4 所示。
表2 试验因素水平设置
从图1～图4 的单因素测试结果可以看出，因素水平处于1、2、3 阶段水解度较高，是水解度峰值出现的主要阶段。以1、2、3 阶段对应的因素指标参数为基准，设计正交试验。测试阶段各个组别的因素水平设置如表3 所示。
表3 正交试验参数设置
图1 温度单因素测试结果
图2 pH 值单因素测试结果
图3 碱性蛋白酶使用量单因素测试结果
图4 水解时间单因素测试结果
2.2 试验数据采集
按照试验设置，分别测试不同组别的苦荞蛋白酶解产物抗氧化活性情况。根据苦荞蛋白酶解产物对DPPH 自由基的清除能力对其活性进行计算。以无水乙醇为溶剂，配制0.2 mmol 的DPPH 溶液。需要注意的是，在试验阶段，DPPH 溶液需要现用现配，以此避免由于溶液静置导致自由基聚集沉降影响测试结果的可靠性。将其与抗坏血酸VC 按照100 μL 的标准，等体积充分混合，构建测试的对照组。按照100 μL 的标准，将试剂分别与测试组样品溶液等体积混合，在30 ℃的环境温度下避光反应30 min。在酶标仪中读取吸光值，设置光栅参数为517 nm。对应的DPPH 自由基清除能力计算公式如下。
式中：P1表示溶液的DPPH 自由基清除率，x0表示对照组试验结果，x1表示测试组试验结果。
对苦荞蛋白酶解产物总抗氧化能力的测定，根据苦荞蛋白酶解产物对ABTS+自由基的清除能力进行计算。将ABTS+工作液与抗坏血酸VC 按照2∶1 的比例配制30 μL 溶液，充分混合后作为试验的对照组。将试剂分别与10 μL 的试验溶液充分混合，在室温环境下反应6 min 后，在酶标仪中读取吸光值，设置光栅参数为414 nm。ABTS+自由基清除能力计算公式如下。
式中：P1表示溶液的ABTS+自由基清除率，y0表示对照组试验结果，y1表示测试组试验结果。
测试阶段各组别因素水平设置下抗氧化活性检测结果如表4 所示。从表4 可以看出，对比不同组的测试结果，e 组的DPPH 自由基的清除能力和ABTS+自由基清除能力均处于最高水平，DPPH 自由基清除能力为（85.33±0.011）%，ABTS+自由基清除能力为（22.06±0.005）%。对照表3 参数设置情况可知，e 组温度为45.0 ℃，pH 值为9.0，2709 碱性蛋白酶的使用量为60.0 AU/g，水解时间为4.0 h。试验表明，在此条件下，碱性蛋白酶水解苦荞的抗氧化活性最高。
表4 抗氧化活性检测结果
第一，在温度低于最优水解温度（45.0 ℃）的条件下，温度上升会在一定程度上提高碱性蛋白酶水解苦荞的抗氧化活性；
当温度高于45.0 ℃时，温度上升会在一定程度上降低碱性蛋白酶水解苦荞的抗氧化活性。第二，在pH 值低于最优水解条件（pH 值9.0）时，pH 值上升会在一定程度上提高碱性蛋白酶水解苦荞的抗氧化活性，但作用效果并不明显；
当pH 值高于9.0时，pH 值上升同样会在一定程度上降低碱性蛋白酶水解苦荞的抗氧化活性。第三，2709 碱性蛋白酶使用量在低于最优值（60.0 AU/g）时，会对苦荞水解产物的抗氧化活性起到积极作用；
使用量高于60.0 AU/g 时，不会明显影响苦荞水解产物的抗氧化活性。第四，水解时间对苦荞水解产物的抗氧化活性影响不显著；
当达到最优水解时间条件后，水解时间的增加并不会对抗氧化活性产生影响。第五，在温度、pH 值、2709 碱性蛋白酶使用量以及水解时间4 个因素中，温度对苦荞水解产物的抗氧化活性影响最明显，其次是pH 值。