蒋斐斐,孙丽芃,李亚楠
安徽省亳州市人民医院儿科,安徽亳州 236800
新生儿感染性肺炎是指新生儿在宫内、分娩过程中或出生后吸入胎粪、羊水、胃内容物等，或是娩出后感染细菌、病毒等病原体，导致的肺部炎症病理改变[1]。临床上，根据新生儿感染性肺炎病因可分为吸入性肺炎与感染性肺炎两种[1]，且不同类型肺炎发病机制、临床表现差异不明显，导致临床诊疗难度较大。临床上以新生儿感染性肺炎更为常见[2-3]，故本研究选择新生儿感染性肺炎进行研究。病原学检查是新生儿感染性肺炎常用的诊断“金标准”，能指导临床治疗，但是该诊断方法所需时间长[4-5]。微小RNA(miRNA)是一类高度保守的非编码核苷酸，与机体免疫功能存在明显的差异性。外周血miR-223在肺炎患儿中呈高表达，能作为肺炎早期诊断指标之一，用于评估患儿病情严重程度[6]。Toll样受体2(TLR2)是Toll家族成员之一，在人体中具有广泛的作用，可识别不同类型病原微生物抗原成分，但是该指标在新生儿感染性肺炎中的应用研究较少[7]。因此，本研究将新生儿感染性肺炎患儿纳入研究，旨在探讨miR-223、TLR2在新生儿感染性肺炎中的表达情况及对临床诊断的价值，现报道如下。
1.1一般资料 将2018年5月至2021年3月本院收治的67例新生儿感染性肺炎患儿作为观察组，男34例、女33例，日龄0～32 d，平均(13.58±4.51)d，孕周38～42周、平均(40.13±1.75)周，母亲分娩次数1～3次、平均(1.65±0.51)次，分娩方式：顺产39例、剖宫产28例。另外，将本院同期健康新生儿51例作为对照组，男32例、女19例，日龄4～33 d、平均(13.62±4.56)d，孕周37～42周、平均(40.06±1.71)周，分娩方式：顺产40例、剖宫产11例。本研究获得本院伦理委员会批准。受试者家属均签署知情同意书。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：(1)观察组患儿符合新生儿感染性肺炎诊断标准[8]，经血常规、临床表现、影像学检查确诊；
(2)均能配合完成miR-223、TLR2检查；
(3)单胎。排除标准：(1)有先天畸形、一般情况较差或器质性疾病；
(2)伴有其他感染性疾病及严重肝、肾功能异常；
(3)研究期间死亡或转上一级医院；
(4)有药物过敏史、禁忌证。
1.2仪器与试剂 FSCS Vantage流式细胞仪购自美国BD公司；
PCR扩增仪购自Biometra公司；
MX3000PTM荧光定量PCR仪购自Stratagene公司；
白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒购自南京博湃生物技术有限公司；
反转录试剂盒购自美国Sigma公司。酶免检测仪购自美国Beckman公司；
VIDAs全自动荧光免疫分析仪购自法国梅里埃公司；
RNA提取Trizol试剂购自美国Sigma公司；
TLR2相关抗体购自美国Abcam公司；
降钙素原(PCT)检测试剂盒均购自法国梅里埃公司。
1.3方法
1.3.1标本采集及保存 根据患儿病原学检查结果和病情，对其进行相应的治疗，分别于治疗前、后抽取静脉血3 mL。对照组采集脐带血3 mL，以2 000 r/min离心10 min，分离得到血清，于-80 ℃冰箱内保存，待测。
1.3.2miR-223检测 采用实时荧光定量PCR法测定miR-223水平，利用Trizol法提取血液标本的总RNA，利用酶标仪测定其浓度。将总RNA按反转录试剂盒说明书逆转为cDNA。反转录条件：30 ℃ 20 min，35 ℃ 30 min，75 ℃ 10 min。实时荧光定量PCR反应体系：cDNA模板8 μL、SYBRP Green 10 μL、PCR Primer mix 2 μL；
反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，连续完成40个循环。以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法计算血液标本中miR-223的相对表达水平。引物设计见表1。
表1 引物设计
1.3.3治疗方案 观察组均给予常规对症支持治疗，具体方法如下:给予抗感染、平喘及退热等治疗，7 d治疗后评估效果[9-10]。观察组治疗后记录为观察组-T。
1.3.4指标的测定 采用流式细胞仪测定TLR2的表达水平(检测抗体购自美国Abcam公司)，取血液标本100 μL于流式细胞管，加入FITC-抗TLR2抗体10 μL，快速震荡混匀，室温下避光孵育15 min。将流式细胞管以2 000 r/min离心5 min后弃上清，用流式细胞仪进行检测。采用ELISA测定IL-6水平；
采用全自动荧光免疫分析仪测定降钙素原(PCT)水平[11]。
2.1血清miR-223、TLR2、IL-6及PCT水平比较 治疗前观察组的miR-223、TLR2、IL-6及PCT水平均高于对照组(P<0.05)；
观察组治疗7 d后miR-223、TLR2、IL-6及PCT水平均低于治疗前(P<0.05)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 血清miR-223、TLR2、IL-6、PCT水平的比较
2.2检测指标间的相关性分析 Pearson相关分析显示：血清miR-223与TLR2、IL-6、PCT水平均呈正相关(r=0.492、0.489、0.503，P<0.05)，TLR2与IL-6、PCT水平亦呈正相关(r=0.465、0.542，P<0.05)。
2.3miR-223、TLR2对新生儿感染性肺炎的诊断价值 ROC曲线分析显示：用于新生儿感染性肺炎的诊断，miR-223的最佳截断值为9.12，曲线下面积(AUC)为0.715，TLR2的最佳截断值为2.11，AUC为0.753。miR-223、TLR2联合诊断新生儿感染性肺炎的AUC为0.894，明显高于miR-223、TLR2单项诊断的AUC(P<0.05)。见表3、图1。
表3 miR-223、TLR2单项及联合检测对新生儿感染性肺炎的诊断价值分析
图1 miR-223、TLR2单项及联合检测用于新生儿感染性肺炎的诊断的ROC曲线
新生儿感染性肺炎是儿科常见病、多发病，由于多数患儿发病早期临床症状缺乏典型性，导致患儿诊疗难度较大[12]。同时，新生儿特殊的生理与免疫状态，导致新生儿感染性肺炎发生率较高，随着病程延长，将会增加窒息、呼吸衰竭的发生率。目前新生儿感染性肺炎诊疗难度大，本研究旨在探讨新生儿感染性肺炎新的诊断标志物。
miR-223属于miRNA的一种[13]。miR-223在人体中具有广泛的生物学作用，如参与免疫细胞谱系的发生、分化调控，维持免疫稳态等[14]。miR-223在脓毒症患儿和小儿肺炎支原体感染患者中均呈高表达[15-16]，而且与T淋巴细胞亚群、炎症因子密切相关[17]。由此可见，miR-223异常表达可能与新生儿感染性肺炎存在紧密联系[18]。本研究显示:观察组miR-223、IL-6及PCT水平均高于对照组(P<0.05)，miR-223在新生儿感染性肺炎患者中高表达。
TLR2是新发现的先天性免疫的病原模式识别受体，可介导跨膜信号，激活机体免疫反应。Toll受体与相应的配体结合后，能激活机体炎性反应，并产生瀑布联级反应，可清除机体内的病原体[19]。重症肺炎患者外周血TLR2、TLR4表达水平升高，与炎症反应紧密相关[20]。本研究结果显示：观察组TLR2、IL-6及PCT水平高于对照组(P<0.05)，说明TLR2在新生儿感染性肺炎患者中高表达。
目前临床上对于新生儿感染性肺炎以对症支持治疗为主。本研究对新生儿感染性肺炎患儿均给予对症支持治疗。观察组治疗7 d后miR-223、TLR2、IL-6及PCT水平均低于治疗前(P<0.05)，观察组治疗后miR-223、TLR2及IL-6、PCT述评均明显降低(P<0.05)，而且观察组治疗后miR-223、TLR2、IL-6及PCT水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-223、TLR2在新生儿感染性肺炎治疗后水平降低，能较好反映患儿肺炎治疗的效果。本研究进一步分析了miR-223、TLR2在新生儿感染性肺炎诊断中的价值。miR-223、TLR2联合检测用于诊断的灵敏度与特异度均高于miR-223、TLR2单项检测。血清miR-223与TLR2、IL-6及PCT水平呈正相关，并且TLR2与IL-6及PCT水平也呈正相关。提示血清miR-223和TLR2与IL-6及PCT一样具有早期诊断新生儿感染性肺炎的能力。因此，临床上对于疑似新生儿感染性肺炎者，应加强miR-223、TLR2水平测定，从而辅助诊断。
综上所述，miR-223、TLR2在新生儿感染性肺炎中呈高表达，而且二者联合测定具有较高的灵敏度与特异度，能为新生儿感染性肺炎的诊疗提供参考依据。但是，本研究中亦存在诸多局限性与不足，研究中纳入病例数较少，需进一步加大样本量进行研究。
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