沈凯 刘彤
原发性肝癌是来源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，其中肝细胞癌是原发性肝癌最常见的类型，占85%～90%[1-2]。肝细胞癌的发病率和病死率均较高，目前治疗肝细胞癌的手段包括手术切除、射频消融、经导管化疗栓塞、放化疗、分子靶向药物等，但患者的预后仍不容乐观，5年生存率为5%～30%[3-4]。因此，探讨肝细胞癌发病的分子机制、发现新的肝细胞癌标志物有助于疾病的早期诊治。研究表明，p53凋亡刺激蛋白2（apoptosis-stimulating of p53 protein 2，ASPP2）在多种人类恶性肿瘤的发病中起重要作用，通过调控野生型p53的功能可起到促凋亡作用，但目前国内关于ASPP2在肝细胞癌发病中的作用仍停留在动物实验和细胞实验阶段[5-6]，尚缺乏ASPP2与肝细胞癌发病关系的临床证据。因此，本研究以接受手术切除治疗的肝细胞癌患者为对象，探讨肝细胞癌组织ASPP2表达及临床意义。
1.1 对象 选取2016年6月至2019年6月在首都医科大学附属北京同仁医院接受手术切除治疗的80例肝细胞癌患者为研究对象，其中男45例，女35例；
年龄35～62（49.85±8.83）岁。纳入标准：（1）经术后病理诊断为肝细胞癌；
（2）临床病例资料和术后随访资料完整；
（3）肝细胞癌组织和癌旁正常组织样本完整。排除标准：（1）术前接受过放化疗；
（2）既往有其他恶性肿瘤史；
（3）合并除乙肝外的其他类型肝炎。本研究经本院医学伦理委员会审查通过，所有患者签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 ASPP2 mRNA表达水平检测 采用qRT-PCR法。取肝细胞癌组织及癌旁正常组织，按照试剂盒说明书进行总RNA提取、反转录合成cDNA及qRT-PCR检测。在qRT-PCR仪上完成PCR反应，得到ASPP2和β-actin的循环曲线及循环阈值，以β-actin为内参，按照公式2-ΔΔCt计算 ASPP2 mRNA表达水平。
1.2.2 ASPP2蛋白表达水平检测 采用免疫组化染色法。取肝细胞癌组织及癌旁正常组织制作病理切片，按照试剂盒说明书进行ASPP2免疫组化染色，在显微镜下观察并对阳性染色百分比和染色强度进行评分。阳性染色百分比评分标准：阴性为0分，1%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%～100%为4分；
染色强度评分标准：阴性为0分，弱阳性为1分，中度阳性为2分，强阳性为3分。计算阳性染色百分比评分与染色强度评分的乘积，总评分0～5分为ASPP2蛋白低表达，6～12分为ASPP2蛋白高表达。
1.2.3 X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）、p53蛋白表达水平检测 采用Western blot法。取肝细胞癌组织，使用组织裂解液进行裂解，12 000 g、4℃离心10 min后收集上清液，采用BCA法检测上清液蛋白浓度，根据检测结果将含有30 μg蛋白的上清液样本用于Western blot检测。经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭硝酸纤维素膜1～2 h，用XIAP一抗（1∶1 000稀释）、p53一抗（1∶1 000稀释）、β-actin一抗（1∶5 000稀释）4℃孵育过夜；
次日用辣根过氧化物酶二抗（1∶5 000稀释）孵育硝酸纤维素膜1 h，最后在凝胶成像系统内成像得到蛋白条带，根据条带灰度值计算XIAP、p53蛋白表达水平。
1.2.4 术后随访 术后采用门诊或住院复查、电话回访等方式进行随访，随访时间截至2021年3月31日，主要随访内容为总生存情况和无病生存情况。
1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；
不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料组间比较采用χ2检验。绘制Kaplan-Meier生存曲线，计算累积无病生存率和5年总生存率，组间比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 肝细胞癌组织及癌旁正常组织ASPP2表达水平比较 肝细胞癌组织ASPP2主要表达于细胞质和细胞核，见图1。肝细胞癌组织ASPP2 mRNA表达水平、蛋白高表达率和蛋白表达评分均明显低于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。
表1 肝细胞癌组织及癌旁正常组织ASPP2表达水平比较
图1 肝细胞癌组织及癌旁正常组织p53凋亡刺激蛋白2蛋白表达（A：肝细胞癌组织；
B：癌旁正常组织；
免疫组化染色，×100）
2.2 原发性肝癌组织ASPP2蛋白表达与临床病理特征的关系 原发性肝癌组织ASPP2蛋白表达与病理分期、临床分期、脉管浸润等有关（均P＜0.05），与性别、年龄、HBV感染、肝硬化、甲胎蛋白水平、肿瘤数量、包膜侵犯等均无关（均P＞0.05），见表2。
表2 肝细胞癌组织ASPP2蛋白表达与临床病理特征的关系[例（%）]
2.3 肝细胞癌组织ASPP2蛋白表达与患者预后的关系 ASPP2蛋白高表达患者累积无病生存率和累积5年总生存率均明显高于ASPP2蛋白低表达患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2。
图2 ASPP2蛋白高表达与低表达患者的Kaplan-Meier生存曲线（A：无病生存率；
B：5年总生存率）
2.4 肝细胞癌组织ASPP2蛋白表达与XIAP、p53蛋白表达的关系 ASPP2蛋白高表达的肝细胞癌组织XIAP蛋白表达水平明显低于ASPP2蛋白低表达的肝细胞癌组织，而p53蛋白表达水平明显高于ASPP2蛋白低表达的肝细胞癌组织，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3和表3。
表3 肝细胞癌组织ASPP2蛋白表达与XIAP、p53蛋白表达的关系
图3 不同ASPP2蛋白表达的肝细胞癌组织XIAP、p53蛋白表达的电泳图
肝细胞癌的恶性程度高、临床预后差、5年生存率低，目前已知与肝细胞癌有关的基因包括p53、乙醛脱氢酶2、醌氧化还原酶1等，但具体发病机制至今仍未阐明。甲胎蛋白、α-L-岩藻糖肝酶、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3等是筛查肝细胞癌常用的标志物[7-8]，但诊断疾病的灵敏度均不佳，多数患者在病情进展至中晚期才会出现血清肿瘤标志物异常升高，目前尚缺乏能够早期诊断肝细胞癌的标志物。因此，探讨肝细胞癌的发病机制不仅有助于发现疾病新的治疗靶点，也有助于发现疾病诊断及病情评估新的标志物。
ASPP家族包括ASPP1、ASPP2、ASPP3，其中ASPP2在消化系统恶性肿瘤发病中的作用受到广泛关注。Yin 等[9]、Liu 等[10]、Buti等[11]分别在结直肠癌、食管癌、胃癌患者肿瘤组织中检测到ASPP2表达降低。ASPP2具有广泛的促凋亡作用，能够显著增强抑癌基因p53诱导的促凋亡效应。膀胱癌[12]、子宫内膜癌[13]、肾癌[14]相关研究证实，上调ASPP2表达能明显促进癌细胞凋亡，而抑制ASPP2表达能明显抑制癌细胞凋亡。至今，ASPP2在肝细胞癌发病中作用的研究仍停留在细胞实验和动物实验阶段。Liang等[15]、Chen等[16]的细胞实验证实，敲除或敲低ASPP2能明显促进肝细胞癌细胞的存活和增殖；
Wang等[17]的动物实验证实，敲低ASPP2可促进肝细胞癌移植瘤的形成。本研究通过qRT-PCR和免疫组化染色对临床样本进行检测发现，肝细胞癌组织中ASPP2表达水平明显低于癌旁正常组织，这表明ASPP2的低表达与肝细胞癌的发病有关。
ASPP2是细胞凋亡的调控基因，在肝细胞癌发病过程中，细胞凋亡异常与肿瘤病理进程密切相关[18-19]。本研究探讨ASPP2蛋白表达与临床病理特征的关系发现，ASPP2蛋白低表达的肝细胞癌组织病理分期及临床分期更高，且更易发生脉管浸润，这表明ASPP2蛋白低表达与肝细胞癌的病理进展有关，与其介导的促凋亡效应吻合。进一步探讨ASPP2蛋白表达与预后的关系发现，肝细胞癌组织ASPP2蛋白低表达患者累积无病生存率和累积5年总生存率均较低，这表明ASPP2低表达与肝细胞癌患者预后不良有关。
目前关于ASPP2促进肝细胞癌细胞凋亡的认识不断在深入。Yang等[20]研究证实，ASPP2对肝细胞癌细胞促凋亡基因p53的表达和抗凋亡基因XIAP表达具有调控作用。本研究利用已有的肝细胞癌组织样本对ASPP2下游的p53、XIAP蛋白表达进行分析，结果显示与ASPP2蛋白高表达的肝细胞癌组织比较，ASPP2蛋白低表达的肝细胞癌组织XIAP蛋白表达水平升高，而p53蛋白表达水平明显降低，提示肝细胞癌发病过程中低表达的ASPP2可能通过增加XIAP表达、降低p53表达的方式来发挥抑制癌细胞凋亡的作用。但以上结果仍需今后更多细胞实验或动物实验来验证。
综上所述，肝细胞癌组织ASPP2低表达与病理进展、预后不良有关，其作用机制可能与调控XIAP、p53有关。本研究结果为今后深入认识肝细胞癌的发病机制、发现肝细胞癌新的标志物提供了思路。
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