张 彤，李 玥，杨 霞，白 冰，李一权，房金波，韩继成，李 霄，金宁一，朱羿龙，朱光泽
（长春中医药大学吉林省院士工作站，长春 130117）
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性肠炎炎症性疾病，其病因尚不明确。现已知炎症损伤和肠道菌群失调对UC的发生发展起到了至关重要的作用[1-2]。在UC的发展过程中，异常活化的炎症信号通路会分泌大量的促炎因子，这些促炎因子能够聚集于受损的肠组织[3-4]，并持续性损伤肠黏膜导致肠黏膜屏障减弱[5]，进而使得相关肠道微生物侵入肠黏膜[6]。在绝大多数UC患者受损的结肠粘膜样本中都发现了肠道微生物[7]，这些微生物代谢产物中的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）能够激活toll样受体以调节炎症细胞因子的分泌，进而激活相应的促炎反应以加剧炎症损伤[8-9]。因此，肠道菌群失调会促进炎症损伤加剧UC患者的病程，甚至可能会诱发癌变[10-11]。总之，肠道菌群失调对UC患者的病程进展与康复速度有着重要的影响。
平贝母是百合科贝母属多年生草本植物，其干燥鳞茎具有止咳化痰、润肺散结的功效，主产于辽宁、吉林和黑龙江。平贝母中含有多种活性成分，包括生物碱类、生物碱苷、腺苷类和多糖类等，其中异甾体生物碱是其主要的生物活性成分[12]，具有止咳[13]、祛痰[14]、抗肿瘤[15]、抗炎[16]、抗菌和抗溃疡[13]等功效。贝母属异甾体生物碱具备的抗炎、抗菌和抗溃疡活性可能使其成为预防或治疗溃疡性结肠炎的潜在药物。平贝母作为吉林省道地药材，以靖宇平贝母的质量最佳。因此，本研究以靖宇平贝母浸出物作为研究目标，通过探讨其对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠症状及肠道菌群的影响，明确靖宇平贝母浸出物抗溃疡性结肠炎效果，并分析其引起的肠道菌群变化在抗溃疡性结肠炎上所发挥的作用。
1.1 实验动物
C57BL/6J雄性小鼠，体质量22～24 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，动物许可证号码：SCXK（京）2019-0010。
1.2 试剂
靖宇平贝母浸出物由吉林省鼎信检测有限公司提供，浸出物由DMSO溶解，并用玉米油稀释。葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）（36，000-50，000 M.Wt.）购自MP Biomedicals公司；
玉米油购自MedChemExpress公司。
1.3 实验动物分组、造模与给药
将雄性C57BL/6J小鼠随机分成4组，即DSS组、DSS+浸出物组（8 mg·kg-1灌胃）、浸出物组（8 mg·kg-1灌胃）和对照组，每组8只。每天记录小鼠疾病活跃指数（disease activity index，DAI）。15 d后，取各组的肠组织拍照并测量结肠长度，分离结肠内容物，用于后续实验分析。具体实验流程见图1。
1.4 疾病活跃指数评分
每天记录小鼠的疾病活跃指数，DAI评分总分=体质量下降百分比+粪便黏稠度+粪便潜血，评分细则详见文献[17]。
1.5 肠组织HE染色
取实验小鼠肠组织，分离结肠和盲肠，分别置于4%多聚甲醛组织固定液中，HE染色与肠组织病理学评分由武汉赛维尔生物科技有限公司完成。组织病理学评分=上皮组织损伤评分+炎性浸润评分[18]。
1.6 16S rRNA分析
所有结肠内容物样品的16S rRNA分析由北京百迈客生物科技有限公司完成。
1.7 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件进行数据统计，并且以均数±标准差（±s）表示，组间比较均采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 靖宇平贝母浸出物抑制模型小鼠体质量变化
靖宇平贝母浸出物对溃疡性结肠炎小鼠体质量变化影响见图1。结果表明在第12天，DSS组和浸出物+DSS组体质量出现明显的下降趋势。从第13天到第15天，浸出物+DSS组体质量下降率显著性低于DSS组（P＜0.05）。从第0天到第15天，浸出物组与对照组体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。这些结果表明靖宇平贝母浸出物可以显著性抑制DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠体质量减轻，但对正常小鼠的体质量无显著性影响。
2.2 靖宇平贝母浸出物降低模型小鼠DAI评分
靖宇平贝母浸出物对溃疡性结肠炎小鼠DAI评分变化影响见图2。结果表明在第11天，DSS组和浸出物+DSS组DAI评分出现明显的上升趋势。从第14天到第15天，浸出物+DSS组DAI评分显著性低于DSS组（P＜0.05）。从第0天到第15天，浸出物组与对照组小鼠DAI评分无显著性差异（P＞0.05）。这些结果表明靖宇平贝母浸出物可以显著性改善DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠症状（如体质量损失率、腹泻、便血等），但对正常小鼠的DAI评分无显著性影响（P＜0.05）。
图2 靖宇平贝母浸出物对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠DAI评分的影响
2.3 靖宇平贝母浸出物抑制模型小鼠结肠长度
靖宇平贝母浸出物对溃疡性结肠炎小鼠结肠长度缩短的抑制效果见图3，与浸出物+DSS组（5.77±0.64）cm 比 较，DSS组（5.05±0.39）cm结肠长度显著性缩短（P＜0.01），但是浸出物组（8.02±0.24）cm与对照组（8±0.23）cm结肠长度比较无显著性差异（P＞0.05）。这些结果表明靖宇平贝母浸出物可以显著性抑制DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠缩短，但对正常小鼠的结肠长度无显著性影响（P＞0.05）。
图3 靖宇平贝母浸出物对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠长度的影响
2.4 靖宇平贝母浸出物减轻模型小鼠肠组织损伤
通过实验小鼠结肠和盲肠HE染色病理分析，靖宇平贝母浸出物对溃疡性结肠炎小鼠肠组织损伤的抑制效果见图4。DSS组的结肠组织黏膜层可见大面积溃疡，肠上皮被破坏，固有层肠腺消失，并伴有大量多量的炎性细胞浸润；
浸出物+DSS组的结肠组织黏膜层可见多处溃疡，肠上皮被破坏，固有层腺体数量减少，并伴有部分炎性细胞浸润。DSS组结肠组织病理学评分显著性高于浸出物+DSS组（P＜0.001）。DSS组的盲肠组织可见多处溃疡，肠上皮被破坏，固有层肠腺消失，并伴有部分炎性细胞浸润；
浸出物+DSS组的盲肠组织黏膜层可见基础溃疡，固有层肠腺数量减少，并伴有少量炎性细胞浸润。DSS组盲肠组织病理学评分显著性高于浸出物+DSS组（P＜0.001）。但浸出物组与对照组的结肠或盲肠组织都是皱襞结构清晰，黏膜层肠上皮结构完整，上皮细胞形态结构正常，固有层肠腺数量丰富等，未见明显炎症，且浸出物组结肠或盲肠组织病理学评分与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。这些结果表明靖宇平贝母浸出物可以显著性减轻DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠肠组织损伤和炎性细胞浸润，但对正常小鼠的肠组织无显著性的病理损伤。
图4 靖宇平贝母浸出物对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠肠组织损伤的影响（放大50×和100×）
2.5 靖宇平贝母浸出物改善模型小鼠肠道菌群结构
靖宇平贝母浸出物对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群结构的影响见图5。其中稀释性曲线如图5A所示，测序量到达一定数值后，OUT数量稳定，样本曲线趋于平稳，表明本次实验每个样本的稀释性曲线充分反映了样本的多样性。通过Alpha多样性分析反映肠道菌群的丰富度和多样性，其中ACE指数衡量物种丰富度，Shannon指数衡量物种多样性。浸出物+DSS组的ACE指数和Shannon指数均显著性高于DSS组（P＜0.05），该结果表明靖宇平贝母浸出物能够显著性增加DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠的肠道菌群丰富度和多样性。
图5 靖宇平贝母浸出物对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群结构的影响
2.6 靖宇平贝母浸出物影响模型小鼠肠道菌群组成
靖宇平贝母浸出物对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群组成的影响见图6。在门类水平上（图6A）与DSS组比较，DSS+浸出物组Firmcutes相对丰度显著性升高（P＜0.000 1），Proteobacteria相对丰度显著性降低（P＜0.000 1）。在属类水平上（图6B）与DSS组比较，DSS+浸出物组Escherichia和Bacteroides相对丰度显著降低（P＜0.05），Parasutterella、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcaceae_UCG-014和Faecalibaculum相对丰度显著性升高（P＜0.01）。在种类水平上（图6C）与DSS组比较，DSS+浸出物组Escherichia_coli和Bacteroides_vulgatus相对丰度显著性降低（P＜0.0001），Faecali-baculum_rodentium相对丰度显著性升高（P＜0.0001）。这些结果表明靖宇平贝母浸出物能够改善DSS诱导溃疡性结肠炎模型小鼠的肠道菌群失调，具体表现在增加潜在有益菌丰度，降低潜在有害菌丰度。
图6 靖宇平贝母浸出物对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群组成影响
越来越多的研究表明，肠道菌群组成的变化能够显著性影响肠道免疫和UC进程[19-20]。肠道黏膜固有层含有大量炎性效应细胞和抑制炎症反应的调节细胞，二者都处于高度动态平衡的状态[21]。然而，肠道菌群组成和多样性的失调会严重影响肠黏膜的炎症反应并打破这种平衡[22]，进而导致肠黏膜相关炎症因子过度激活造成炎性损伤[23]。因此，肠道菌群失调引起的长期或慢性炎症与UC发展密切相关[24]。
正常情况下，UC患者肠黏膜内的微生物组成和细菌总数会发生显著性变化，且细菌多样性明显减少[25]。与健康个体相比，UC患者体内促炎细菌显著性增加，抗炎细菌显著性减少[26]。研究发现，在UC的发展过程Proteobacteria（大多数为已知致病菌）丰度显著性升高[27]，Firmicutes和Bacteroidetes（可以产生短链脂肪酸调节脂代谢、保护肠黏膜损伤和抑制致病菌生长）丰度显著性下降[28-29]。在UC患者的粪便菌群中，一些潜在有害细菌（如Escherichia-Shigella、Helicobacter、Campylobacter和Fusobacterium）丰度显著性升高，这些潜在有害菌能够显著性影响肠道炎症和肠上皮细胞通透性[30]；
此外，潜在有益菌Firmicutes成员的数量显著性下降，特别是 Ruminococcus bromii、Eubacterium rectale、Roseburia和Akkermansia，这些潜在有益菌可以产生大量具有抗炎作用的丁酸和丙酸盐[31]。
在本研究中，与DSS组相比，浸出物+DSS组潜在有益菌Parasutterella、Ruminococcaceae_UCG-014、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Faecalibaculum（Faecalibaculum_rodentium）与潜在有害菌Escherichia（Escherichia_coli）和Bacteroides（Bacteroides_vulgatus）均发生了显著性变化。其中Parasutterella能够产生琥珀酸，细菌来源的琥珀酸盐通过促进严格厌氧细菌的定殖，对宿主产生有益作用[32]。Ruminococcaceae_UCG-014[33]、Lachnospiraceae_NK4A136_group[34]和Faecalibaculum（Faecalibaculum_rodentium）[35]可以通过产生丁酸盐来改善UC；
Escherichia（Escherichia_coli）为机会致病菌能够产生LPS来激活促炎反应并增加炎性损伤。Bacteroides（Bacteroides_vulgatus） 被认为是致病菌能够产生Bacteroides_vulgatus蛋白酶来加剧肠道损伤[36]。靖宇平贝母浸出物可以通过改善肠道菌群失调，增加潜在有益菌（Parasutterella、Ruminococcaceae_UCG-014、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Faecalibaculum）丰度，降低潜在有害菌（Escherichia和Bacteroides）丰度，来缓解DSS诱导溃疡性结肠炎症状，具体表现为体质量变化减轻、DAI评分降低、结肠缩短长度。