陈家洁 陈孙云
结核病的病原学检查是明确诊断结核病的重要方法。中华人民共和国国务院办公厅发布了《“十三五”全国结核病防治规划》，要求肺结核患者病原学阳性率要达到50%以上[1]。目前在临床上使用的结核病的病原学检测方法主要有：涂片镜检、培养、分子生物学检测技术等。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(GeneXpert MTB/RIF，以下简称“GeneXpert检测”)为基于荧光定量聚合酶链式反应技术(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)，直接检测标本中有无结核分枝杆菌感染及利福平耐药基因[2]，逐渐在国内得到推广。江阴市2017年尚未开展GeneXpert检测技术，从2020年开始逐步推广GeneXpert检测技术，并于2020年底年实现了全市的检测覆盖。本文对江阴市2017年、2020-2021年活动性肺结核患者的病原学阳性率的差异进行分析，并对利福平耐药患者的检测进行评价，为该技术在基层结核病定点医院大规模推广提供借鉴经验。
一、资料来源
病例资料来源于《中国疾病预防控制信息系统》的子系统《结核病信息管理系统》中江阴市2017年、2020年-2021年的结核病患者的登记数据。
二、患者纳入与排除标准
纳入标准：(1)肺结核诊断参照《WS 288—2017肺结核诊断》标准[3]，以病原学检查为主，结合临床症状和影像学进行综合判断，以病原学、病理学结果作为确诊依据[4]；
(2)本文的研究对象为活动性肺结核患者(包括病原学阳性和病原学阴性患者)；
(3)所有患者经过临床症状体征、影像学表现、免疫学检查、病原学检测及抗结核治疗后疗效观察，最终确诊为肺结核，均符合新的诊断标准[3]。排除标准：(1)病理学阳性肺结核；
(2)结核性胸膜炎；
(3)肺外结核；
(4)肺炎、肺脓肿、非结核分枝杆菌肺病等患者。本研究经院伦理委员会审批([2021]伦审研第[065]号)。
三、患者纳入情况
1 江阴市从2020年开始逐步推广GeneXpert检测技术，并于2020年底实现了全市的完全检测覆盖，检测对象范围扩大至所有的疑似肺结核患者。江阴市在2018-2019年在所有涂阴肺结核患者中开展环介导等温扩增技术(LAMP技术)检测，故2018-2019年的数据不纳入本研究中。
2 2017年和2020-2021年江阴市登记的肺结核患者总数为1434例，其中结核性胸膜炎患者118例，病理学阳性患者62例，故纳入本文中的活动性肺结核患者总数为1254例，其中男904例，女350例，男女比例为2.58：1，年龄13～85岁，平均(49.3±19.1)岁。
四、相关定义
1 病原学阳性包括涂片阳性、仅培养阳性、仅分子生物学阳性[5]。
2 病原学阴性是指涂片、培养、分子生物学检测均阴性[4]。
3 仅培养阳性：分枝杆菌培养阳性且菌种鉴定为结核分枝杆菌复合群，但涂阴GeneXpert阴性或GeneXpert 未检测的患者[6]。
4 仅分子生物学阳性(本文指仅GeneXpert阳性)：GeneXpert检测到结核分枝杆菌核酸，但涂阴培阴或培养未检测的患者[6]。
5 病原学阳性率是指某年登记的活动性肺结核患者中，病原学阳性患者所占比例[6]。病原学阳性率(%)=(涂片阳性+仅培养阳性+仅GeneXpert阳性)患者例数/活动性肺结核患者例数(病原学阳性患者和病原学阴性患者)×100%[5]。
五、检测方法
1 痰标本采集
患者(包括门诊和住院患者)深呼吸后咳出痰液，用痰液收集瓶收集3～5mL痰标本(可多次留取)。建议清晨清水漱口后，留取支气管深部的痰液，避免留取唾液。
2 支气管镜检查
患者使用Olympus BF260或者BF290电子支气管镜进行检查，根据影像学选择病变部位的支气管进行灌洗，灌入40～60mL生理盐水，负压吸引回收灌洗液至无菌容器。同一份BALF标本行涂片和GeneXpert检测。
3 涂片抗酸染色法
采用萋-尼抗酸染色，按照《结核病实验室检验规程》[7]进行痰或者肺泡灌洗液涂片抗酸染色，首先用抗酸染色全自动显微扫描系统(杭州上池科技有限公司提供，型号：MSS-TB-01)进行扫描(每张待检玻片设定3300个连续视野进行扫描)，技术人员再对系统软件提示为阳性的玻片进行人工镜检复核后判读结果。同一例3份完成涂片的标本中，任何一份发现抗酸杆菌即判定为涂片阳性。
4 GeneXpert检测
取合格痰标本或者肺泡灌洗液标本1 mL,加入2mL标本处理液,震荡混匀后,静置15min，取2mL 液化标本加入 Xpert MTB/RIF 试剂盒(美国 Cepheid 公司),置于检测模块,仪器自动运行检测,2h后由系统自动判读 MTB 检测结果[8]。
5 痰培养
按照国家标准进行检测(Bacth960培养基)。2017年、2020-2021年，因我市未常规开展痰培养检测技术，是将痰标本送至上级传染病医院(无锡市第五人民医院)进行检测。
六、统计学处理
采用 SPSS 21.0 软件对数据进行统计学分析，计数资料以“率(%)”表示，两组间比较采用χ2检验，以P<0.01为差异有统计学意义。
一、病原学检测的送检情况(具体见表1)
表1 2017年和2020-2021年江阴市活动性肺结核患者的病原学送检情况[n(%)]
2017年501例患者行痰涂片检测。80例患者行痰培养检测，阳性38例(痰涂阴培阳11例、痰涂阴培阴40例、痰涂阳培阳27例、痰涂阳培阴2例)。
2020年404例患者行涂片检测。328例患者行GeneXpert检测。有6例痰涂阴患者行痰培养检测，阳性1例。有26例患者行支气管镜检查：肺泡灌洗液涂片检测26例，阳性9例；
肺泡灌洗液GeneXpert检测13例，阳性12例(BALF涂阴GeneXpert阳性11例、BALF涂阳GeneXpert阳性1例、BALF涂阴GeneXpert阴性1例)。
2021年349例患者均行涂片和GeneXpert检测。有18例痰涂阴患者行痰培养检测，阳性4例。有46例患者行支气管镜检查：肺泡灌洗液涂片检测46例，阳性17例；
肺泡灌洗液GeneXpert检测39例，阳性35例(BALF涂阴GeneXpert阳性24例、BALF涂阳GeneXpert阳性11例、BALF涂阴GeneXpert阴性3例、BALF涂阳GeneXpert阴性1例)。
二、病原学阳性率
2017年、2020年及2021年江阴市活动性肺结核患者的病原学阳性率分别为44.31%(222/501)、68.56%(277/404)和74.50%(260/349)，差异有统计学意义(χ2=94.576，P<0.001)。2020年我市全面推广GeneXpert检测技术后，2020-2021年我市活动性肺结核患者的病原学阳性率为71.31%(537/753)，明显高于2017年的44.31%(222/501)，差异有统计学意义(χ2=91.816，P<0.001)。具体(见表2)。
表2 2017年和2020-2021年江阴市活动性肺结核患者的病原学检测结果
三、涂阴患者的GeneXpert检测情况
2020-2021年在涂阴活动性肺结核患者中共有135例患者通过GeneXpert检测出阳性，在涂阴活动性肺结核患者中GeneXpert检测阳性率从36.03%(49/136)上升至48.04%(86/179)。具体(见表 3)。
表3 2020-2021年江阴市涂阴肺结核患者的GeneXpert检测情况
四、涂阳患者的GeneXpert检测情况
2020年在227例涂阳活动性肺结核患者中，有192例进行了GeneXpert检测，检测出123例阳性，检测阳性率为64.06%(123/192)，其中发现9例利福平耐药患者。2021年170例涂阳活动性肺结核患者均进行了GeneXpert检测，检出108例阳性，检测阳性率为63.53%(108/170)，其中发现5例利福平耐药患者。2020-2021年，对GeneXpert在涂阳活动性肺结核患者中的检测阳性率进行比较，差异无统计学意义(χ2=2.1524，P=0.1423)。具体(见表4)。
表4 2020-2021年江阴市涂阳肺结核患者的GeneXpert检测情况
五、活动性肺结核患者的GeneXpert检测情况
2020年在活动性肺结核患者中，有328例进行了GeneXpert检测，检测出172例阳性，检测阳性率为52.44%(172/328)。2021年349例活动性肺结核患者进行了GeneXpert检测，检出194例阳性，检测阳性率为55.59%(194/349)。具体(见表5)。
表5 2020-2021年江阴市活动性肺结核患者的GeneXpert检测情况
六、利福平耐药患者的检测
2017年痰培养检测发现利福平耐药患者11例(在痰涂阴培阳患者中发现1例、在痰涂阳培阳患者中发现10例)，2020-2021年GeneXpert检测发现利福平耐药患者16例。在涂阴活动性肺结核患者中，2020-2021年GeneXpert检测出2例利福平耐药患者。
2017年的肺结核诊断标准《WS 288—2017肺结核诊断》[3]将结核病分子生物学检测纳进结核病的病原学检查范畴。痰涂片法简单快捷，成本低，易普及，是国内最普遍使用的结核病检测方法[9]，但痰涂片阳性检出率低。GeneXpert检测技术是利用半巢式实时荧光PCR技术，以rpoB基因为靶基因，提取DNA 后扩增 rpoB 基因 192bp片段进行检测，并用rpoB 基因 81bp 利福平耐药核心区设计引物、探针，5个相互重叠分子探针检测利福平耐药[10]。
因本研究中患者总数已剔除病理学阳性患者的人数(2017年病理学阳性25例，2020年病理学阳性19例，2021年病理学阳性18例)故本文中涂片阳性率略高于冒小欧等[11]的研究结果。将病理学阳性人数纳入患者总数中，计算2017年、2020年、2021年的涂片阳性率分别为40.11%(211/526)、53.66%(277/423)、46.32%(170/367)。我市2017年的涂片阳性率与李国莉[5]等的39.15%研究结果相近。
低质量、不一致的痰涂片染色技术，标本碎屑，人眼视觉的变异和疲劳等因素会导致传统显微镜人工阅片来检测痰涂片的灵敏度低至40%[12]。使用基于人工智能计算机辅助诊断技术的自动显微镜系统对结核病进行自动诊断，可以提高其抗酸杆菌检出率、提高工作效率[13]。丁北川等[14]研究表明：抗酸染色全自动显微扫描系统检测痰涂片阳性率(43.22%)明显高于传统抗酸杆菌染色镜检(38.24%)，并且对于低阳性级别痰标本，全自动显微扫描系统具有一定的优势。将病理学阳性人数纳入患者总数中，计算2020-2021年江阴市的涂片阳性率为50.25%(397/790)。自我市2020年引进抗酸染色全自动显微扫描系统后，我市涂片阳性率较前明显提高。
2017年我市肺结核病原学诊断的主要方法是痰涂片和痰培养。相较于传统的肺结核病原学诊断技术，分子生物学检测能明显提高肺结核病原学方面诊断的准确性。江阴市2018-2019年在所有涂阴肺结核患者中开展环介导等温扩增技术(LAMP技术)检测。冒小欧等[11]研究表明：江阴市充分利用分子生物学检测技术，极大地提高了病原学诊断阳性率，2018-2019年病原学诊断阳性率达到54.22%。从病原学阳性率数据来看，我市的肺结核病原学阳性率从2017年的44.31%显著提升至2021年的74.50%，其主要的原因是在于GeneXpert检测技术在江阴市得到全面推广应用。《江苏省“十四五”结核病防治规划》，要求肺结核患者病原学阳性率要达到62%以上[15]，2020-2021年江阴市主要通过涂片和GeneXpert检测技术应用，我市肺结核患者病原学阳性率已经达到上述要求。
对所有涂阴肺结核患者进行GeneXpert检测，能有效提高病原学阳性率。2020-2021年江阴市在涂阴活动性肺结核患者中共有135例患者通过GeneXpert检测出阳性。在涂阴活动性肺结核患者中GeneXpert检测阳性率从36.03%(49/136)上升至48.04%(86/179)。本研究中，GeneXpert在涂阴活动性肺结核患者中的检测阳性率与王蔚等[16]的研究结果相近。说明涂阴肺结核患者在涂片镜检后有必要补充做GeneXpert检测。
2020年和2021年，江阴市在涂阳活动性肺结核患者中GeneXpert的检测阳性率分别为64.06%(123/192)、63.53%(108/170)，比文献报道[10]的略低，分析原因可能是(1)本研究中每位患者用痰液收集瓶收集3～5mL痰标本(可多次留取)，未用同一份痰标本同时进行涂片及GeneXpert检测，而是同一位患者的两份痰标本分开进行检测，可能与痰标本的质量有关系，这也是本研究需要改进的地方；
(2)患者留取痰标本的时间不同，有些患者是同一时间留取2～3份痰标本，有些患者是多次留痰，痰GeneXpert检测时间有滞后性：先留取痰标本进行痰涂片检测，在痰涂片结果出来后，再留取痰标本进行GeneXpert检测，可能第一次的痰涂片标本质量更高；
(3)本研究中进行支气管镜检查的患者，留取肺泡灌洗液标本，采用同一标本进行涂片和GeneXpert检测，涂片与GeneXpert检测结果一致率达90%以上，提示标本采集送检一致性可提高GeneXpert阳性率；
(4)可能与GeneXpert检测方法的检测阈值有关。
2020年和2021年，江阴市在活动性肺结核患者中GeneXpert的检测阳性率分别为52.44%(172/328)、55.59%(194/349)，比文献报道[17]的GeneXpert检测阳性率39.17%略高，可能是：文献中采用的检测样本均为痰标本，本文中的检测样本除痰液外，还包括支气管镜肺泡灌洗液。临床中有一部分患者自主咳出痰液较少，也有少部分患者无咳痰。支气管镜检查是无法自主排痰患者必不可少的检查手段[18]。虞忻等[19]的研究结果显示：支气管镜BALF Xpert阳性率57%明显高于痰Xpert阳性率32.3%。所以在基层结核病定点医院，在没有支气管镜检查禁忌症的情况下，应尽量提高疑似肺结核患者的支气管镜检查率，尤其是无咳痰的患者。
结核病的早期诊断及其耐药性的检测，对于很好地控制耐药结核病的传播具有十分重要的意义[20]。传统的痰培养检测，需要6～8周的时间才能得到结果，而通过 GeneXpert 检测技术的使用，能显著缩短诊断肺结核所需时间(可在2小时内得到结果)，同时可以快速检测利福平耐药性，早期制定耐药治疗方案。2017年我市通过痰培养检测发现利福平耐药患者11例。2020-2021年我市未在痰培养检测中发现利福平耐药患者，通过GeneXpert检测发现利福平耐药患者共有16例，并在涂阴活动性肺结核患者中检测出2例利福平耐药患者。《江苏省“十四五”结核病防治规划》[15]，要求结核病定点诊疗机构全部开展分子诊断耐药筛查，缩短诊断时间，对所有疑似肺结核患者进行耐药筛查，最大限度发现耐药结核病患者。自2020年我市引进GeneXpert检测技术后，首先用GeneXpert检测技术对所有疑似肺结核患者进行利福平耐药的初步筛查，如果两次GeneXpert检测(间隔时间24小时以上)发现利福平耐药均阳性，随即将上述患者转至上级传染病医院(无锡市第五人民医院)，极大地缩短了利福平耐药患者的检测时间。
综上所述，通过在我市全面推广使用GeneXpert检测技术，大大提高了基层医院活动性肺结核患者病原学阳性率，并能及早发现结核感染和利福平耐药患者，从而尽早制定治疗方案。该检测技术仅需简单培训即可掌握，只需极少的生物安全设施，不易发生交叉污染。特别是对于尚未开展痰培养检测技术的基层医院，可开展分子诊断耐药筛查，用GeneXpert检测技术作为替代，对所有疑似肺结核患者进行利福平耐药的初步筛查。GeneXpert检测技术非常适合在基层结核病定点医院大规模推广。
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