张 峰 李 燕 李伟华
（济南市人民医院病理科，济南 271100）
肝硬化（hepatic cirrhosis）是由各种慢性肝病发展到肝纤维化后逐渐演变的过程[1]。机体肝硬化之后导致各种严重的不良后果[2-3]。肝硬化的形成是一个循序渐进的过程，最终肝变形变硬形成肝硬化[5-6]。肝功能受损或病情发展严重到肝硬化时，血液中谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）水平均升高。当肝受到刺激时，机体做出一系列反应，过度应答会出现全身变化，活化的巨噬细胞会释放大量肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）等细胞因子，κ基因结合核因子（nuclear factor-κ-gene binding，NFκB）水平也会随之升高。还可诱导炎性因子IL-6的产生，参与肝内炎性损伤过程[6]。中药在治疗各种疾病方面都起到良好的作用。黄芪味甘性温是临床常用中药材之一，具有固表补气、升阳举陷、利尿消肿等作用[7-8]。现代药理研究发现，黄芪具有保护腹膜、肝脏、心脑血管等功效，对肺功能及利尿等方面有一定的改善效果[9]。因此本研究探讨黄芪总黄酮对肝硬化大鼠肝组织病理、代谢指标以及NF-κB的影响。
1.1 实验大鼠与试剂
35只SD大鼠，购买于南京君科生物工程公司，体质量190～210 g，分7笼饲养，室温24℃±1℃，湿度45%～50%，大鼠活动饮水自由。
黄芪总黄酮购于浩翔生物（宝鸡）；
四氯化碳购于亿德瑞生物公司（大连）；
美他多辛片购买于震元制药公司（浙江）；
TRIzol试剂盒购买于百泰克生物公司（无锡）；
酶联免疫试剂盒购买于艾博因生物科技（江西）；
一抗、二抗购买于西格生物科技（上海）；
全自动生化仪购买于赛谱分析仪器公司（滕州）。
1.3 动物分组与肝硬化动物模型建立
将35只健康大鼠随机分为健康组、肝硬化组、低浓度黄芪总黄酮组（低浓度组）、高浓度黄芪总黄酮组（高浓度组）、美他多辛组，每组7只。除健康组外，给予其他组大鼠初次注射40%四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）花生油溶液（0.3 mL/100 g）皮下注射，以后注射CCl4剂量依体质量变化调整，每周2次[10]，一共注射21 d。观察大鼠肝肿胀度，取肝组织H-E染色。对比健康组及造模组指标，确定造模是否成功。
1.4 干预方法
建模后，肝硬化组每天给予四氯化碳花生油等量的橄榄油，每周2次，以后橄榄油剂量依体质量变化调整。肝硬化组用普通饲料及蒸馏水进行饲养。低浓度组给予黄芪总黄酮0.5 mg/kg灌胃；
高浓度组给予黄芪总黄酮2.0 mg/kg灌胃；
美他多辛组给予美他多辛片溶液0.15 mL/10 g灌胃。上述药物均1次/日，各组治疗2周后停止给药，健康组和肝硬化组给予同体积的生理盐水。
1.5 ELISA法检测大鼠肝功能AST、ALT、TBIL水平和血清 TNF-α、IL-6、IL-8、NF-κB、NF-κB p65水平
采大鼠腹腔静脉血，离心机离心（离心转数4 000 r/min，离心时间15 min）收集血清，应用全自动生化仪检测AST、ALT、TBIL 等水平，严格按照试剂盒说明书操作。
大鼠尾部取血2 mL，立即离心（3 500 r/min）取上清液，注入无菌试管中（肝素抗凝），室温静置1 h放入4℃冰箱，取血清采用ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8、NF-κB、NF-κB p65水平。
1.6 H-E染色检验大鼠肝组织病理形态
用戊巴比妥钠麻醉大鼠，处死后分离大鼠肝，取各组大鼠肝组织常规脱水，浸蜡，石蜡包埋，常规切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，染色，脱蜡、水合，透明封片，光镜下观察大鼠肝组织形态学变化。
1.7 TUNEL法检测肝细胞凋亡情况
收集处理完的肝细胞，脱蜡后病理切片，严格按照细胞凋亡试剂盒操作，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI 2种染料染色混匀。再用筛网过滤，在室温条件下避光孵育30 min，然后用PBS洗涤3次，每次5 min，再滴加DAPI避光孵育 5 min，PBS再次清洗4次，每次5 min，用吸水纸吸去切片上的液体，之后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察采集图像。
1.8 Realtime PCR 法检测大鼠肝组织中NF-κB p65、TNF-α mRNA表达
采用TRIzol法提取总RNA，无核酸酶溶解。将提取的RNA转录为cDNA，引物序列见表1。PCR反应条件：42℃ 60 min，72℃作用5 min，4℃终点。每个细胞设置6个复孔，以β- actin为内参，反应条件为95℃预作用3 min，95℃作用5 s，58℃退火，40个循环。采用2-△△CT法计算基因的相对表达量。
表1 引物序列
1.9 免疫印迹检测大鼠肝组织中NF-κB、TNF-α蛋白表达水平
各组大鼠肝组织加入少量胰蛋白酶消化后，加入蛋白裂解液快速混匀，离心后保留上清液，放置于75℃水浴10 min使蛋白变性后放入上样孔中，每组取5 μg蛋白进行电泳实验。将蛋白转移到PVDF膜TBS浸泡10 min，反复PBS冲洗，每次5 min，加入一抗NF-κB、TNF-α抗体（1∶500 ）孵育过夜，后放入二抗辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，（1∶2 000）杂交冲洗。浸入ECL工作液，成像系统对印迹条带的光密度进行分析。β-actin 作为内参，ECL化学发光试系统JY-Clear分析蛋白值。
1.10 统计学处理
采用SPSS 23.0统计学软件进行分析，各组大鼠AST、ALT、TBIL、炎性因子，各组大鼠TNF-α、NF-κB蛋白表达量等比较采用单因素方差分析，计量资料采用±s，以P＜0.05表示差异有统计学意义。
2.1 各组大鼠肝功能AST、ALT、TBIL水平比较
与健康组相比，肝硬化组大鼠AST、ALT、TBIL水平明显升高（P＜0.05）。与肝硬化组相比，低、高浓度组，美他多辛组各指标均显著下降（P＜0.05）。与美他多辛组相比，低、高浓度组降低明显（P＞0.05），低、高浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。
2.2 各组大鼠血清中TNF-α、IL- 6、IL-8、NF-κB水平比较
与健康组相比，肝硬化组TNF-α、IL- 6、IL-8、NF-κB水平明显升高（P＜0.05）。与肝硬化组相比，低、高浓度组，美他多辛组水平明显降低（P＜0.05）。与美他多辛组相比，低、高浓度组降低明明显（P＜0.05），低、高浓度组相比无差异（P＞0.05）（表2） 。
表2 各组大鼠血清ALT、AST、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-8水平比较（n=7， ±s）
表2 各组大鼠血清ALT、AST、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-8水平比较（n=7， ±s）
#P＜0.05 vs 健康组；
*P＜0.05 vs肝硬化组；
△P＜0.05 vs 高浓度组
组别ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）TNF-α（pg/mL）IL-6（ng/mL）IL-8（ng/mL）NF-κB（pg/mL）健康组 79.95±3.89 175.45±7.15 4.76±0.54 2.59±0.79 44.46±0.110.30±0.05 668.23±30.25肝硬化组346.45±5.94#1 158.20±20.26#203.36±8.24#17.56±3.45#130.32±8.89#2.56±1.59#1 302.12±130.16#低浓度组260.03±11.15*# 688.23±10.34*#169.95±5.29*# 9.03±2.56*# 83.45±6.25*#1.38±0.32*# 812.03±15.45*#高浓度组257.02±10.45*# 680.56±5.23*#160.25±2.29*# 8.79±1.32*# 80.78±7.89*#1.34±0.12*# 800.12±10.12*#美他多辛组290.23±20.21*#△ 715.23±15.21*#△178.45±10.42*#△11.23±4.46*#△ 90.23±10.26*#△1.76±1.02*#△ 836.56±70.23*#△P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001
2.3 各组大鼠肝组织病理形态学比较
健康组大鼠肝细胞结构完整、排列整齐，未见明显的细胞变性坏死及其他明显病理变化；
肝硬化组大鼠肝汇管区、小叶间可见大量增生胶原纤维，肝组织出现明显的条索样改变，肝细胞出现明显脂肪变性；
低浓度组、高浓度组、美他多辛组大鼠较肝硬化组肝组织纤维增生明显改善，肝小叶破坏得到改善（图1）。
图1 H-E染色观察各组大鼠肝组织病理形态学比较，×200。A：健康组；
B：肝硬化组；
C：低浓度组；
D：高浓度组；
E：美他多辛组.
2.4 各组大鼠肝细胞凋亡情况比较
与健康组大鼠肝细胞凋亡数量（5±3）个比较，肝硬化组可见大量肝细胞凋亡（47±8）个。与肝硬化组相比，低浓度组、高浓度组和美他多辛组，肝细胞凋亡数均明显降低（P＜0.05）。与美他多辛组大鼠肝细胞凋亡数量（28±8）个相比，低浓度组大鼠肝细胞凋亡数量（13±5）个和高浓度组大鼠肝细胞凋亡数量（14±3）个降低明显（P＜0.05），高浓度组与低浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。
2.5 各组大鼠肝组织NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表达水平比较
与健康组相比，肝硬化组大鼠肝组织中NF-κB、TNF-α及NF-κB p65蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。与肝硬化组相比，低浓度组、高浓度组、美他多辛组大鼠肝组织中NF-κB、TNF-α、NF-κB p65蛋白表达水平明显下降（P＜0.05）。与美他多辛组相比，低、高浓度组组NF-κB、TNF-α及NFκB p65蛋白表达水平降低明显（P＜0.05），低、高浓度组相比无差异（P＞0.05），说明黄芪总黄酮有较好的抗炎效果（图4、5）。
图4 各组大鼠炎性因子表达水平
2.6 各组大鼠肝组织中炎症因子NF-κB、NF-κB p65、TNF-αmRNA 表达水平比较
与健康组相比，肝硬化组肝组织中NF-κB、NF-κBp65及TNF-α mRNA 水平升高（P＜0.05）。与肝硬化组相比，低、高浓度组，美他多辛组肝组织中NF-κB、NF-κBp65、TNF-αmRNA表达水平明显下降（P＜0.05）。与美他多辛组相比，低、高浓度组降低明显（P＜0.05），低、高浓度组相比无显著差异（P＞0.05）（表3）。
表3 各组大鼠 NF-κB、NF-κB p65和TNF-α mRNA表达水平（n=7， ±s）
表3 各组大鼠 NF-κB、NF-κB p65和TNF-α mRNA表达水平（n=7， ±s）
#P＜0.05 vs健康组；
*P＜0.05 vs 肝硬化组；
△P＜0.05 vs高浓度组
组别NF-κB mRNANF-κB p65 mRNATNF-α mRNA健康组1.00±0.001.00±0.001.00±0.00肝硬化组1.83±0.22#1.94±0.17#2.21±0.28#低浓度组1.41±0.18*#1.49±0.13*#1.62±0.23*#高浓度组1.36±0.13*#1.41±0.11*#1.56±0.19*#美他多辛组1.58±0.12*#△1.62±0.16*#△1.85±0.18*#△
图5 各组大鼠TNF-α、NF-κB和NF-κB p65表达水平
随着生活水平的提高，人们的生活习惯和饮食结构都发生了很大的改变，我国的肝硬化发病率也逐年增高。临床上导致肝硬化的原因很多，慢性肝病、长时间大量饮酒、滥用药物或者各种病毒感染均可导致肝硬化[11]。目前治疗肝硬化主要是给予抗病毒、保护肝脏、降酶等治疗，但是会存在一定不良反应[12-13]。随着中医药学的发展，自古黄芪无论是单味药应用还是联合应用都有良好的药用价值[14-17]。本研究探讨黄芪总黄酮对肝硬化大鼠肝组织病理、代谢指标及NF-κB的影响。
肝硬化的发病机制比较复杂，是多因素共同作用造成的，其中炎性反应是造成肝硬化发生的因素之一。炎症反应发生后产生细胞因子和趋化因子，导致各种免疫细胞调控组织进行损伤修复，IL-6、IL-8、TNF-α、NF-κB等均参与其中[18]。TNF-α是一种主要由活化的单核/巨噬细胞产生的重要促炎因子，与肝细胞表面受体结合，激活中性粒细胞，释放大量氧自由基直接造成肝细胞的损伤。TNF-α既可以导致肝细胞坏死，也可诱导其凋亡[21]。TNF-α还可以激活细胞因子级联反应，刺激IL-1和IL-8等的产生，进一步加重肝细胞的损伤或凋亡[20]。NF-κB是细胞中重要的转录因子，NF-κB是一种调控炎症反应的多向因子，参与多种炎性反应的过程。当细胞静息时，NF-κB处于非活性状态，当肝细胞受到刺激时即可激活NF-κB，使其发生转录。有研究表明CCl4诱导肝硬化过程中，CCl4可以改变肠黏膜的通透性，使内毒素增多，诱导NF-κB等转录因子核转位，从而释放TNF-α、IL-8、IL-6等大量炎症因子，从而造成肝细胞的损伤[21]。
有研究表明黄芪对肝纤维化、肝硬化有一定的治疗作用[22]。黄芪中含有多糖、皂苷类、黄酮类等多种成分，其中黄芪总黄酮具有清除自由基、抗病毒、抑制血管通透性等作用。黄芪总黄酮还能降低肝组织羟脯氨酸含量、减轻假小叶的形成，抗肝纤维化的作用。有研究表明，黄芪总黄酮通过调控LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞p38MAPK信号通路以及相关蛋白表达，从而抑制IL-6、TNF-α、NF-κB的生成，发挥抗炎免疫作用[23]。张国欣等[24]将肝缺血再灌注损伤大鼠分成3组，其中黄芪组与模型组相比，黄芪组大鼠肝组织的IL-8、TNF-α、NF-κB的水平指标明显下降，说明黄芪可以抑制肝硬化大鼠TNF-α、IL-8和NF-κB的表达。本研究显示与健康组相比，肝硬化组TNF-α、IL- 6、IL-8和NF-κB水平明显升高，干预后，高浓度组大鼠各指标明显下降，说明黄芪总黄酮具有抗炎的效果。本研究与上述研究一致。
肝是人体代谢器官，肝硬化发生后会导致体内的各个指标代谢紊乱，同时肝血液生化指标也可以反映出肝损伤严重程度，其中主要反映肝细胞炎症损害的重要酶类有AST、ALT。而TBIL异常时，肝细胞损害对胆红素的摄取以及排泄功能降低。但肝受损害时，AST及ALT、TBIL指标升高。有研究显示肝硬化患者经过治疗后血糖、血脂、转氨酶等各指标均降低，肝硬化得到了一定程度的控制。中医认为黄芪具有升阳举陷、益气固表等功效，而现代医学研究表明黄芪具有保护肝脏、增强免疫力及抗菌等功效。有学者认为黄芪可能是通过调控p38MAPK 信号通路，降低血液生化中各个指标，从而对肝起到了保护作用[25]。鲍家卉等[26]报道，低、中、高浓度黄芪提取物均可以降低血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶以及肝中甘油三酯的含量，减轻了小鼠肝纤维化程度，对小鼠肝起到一定的保护作用。段文彪等[27]研究表明，鳖甲煎丸能显著改善肝硬化大鼠的肝损害，恢复肝功能。本研究经过干预后，与肝硬化组相比，高、低浓度组肝硬化大鼠血清中的AST、ALT、TBIL的水平明显下降。本研究与上述研究一致。
综上所述，通过探讨黄芪总黄酮对肝硬化大鼠肝组织病理、代谢指标及NF-κB的影响，表明黄芪总黄酮可以降低肝硬化大鼠的代谢指标，降低NF-κB的水平，从而达到治疗肝硬化的目的。
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