郑楚瑶，张司南，吴元斌，蒋卓*
（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（2.广西果天下食品科技有限公司，广西百色 533612）
百香果，又名西番莲，属西番莲科西番莲属植物，其果肉香气浓郁，因具有百种水果的香气得名。百香果由内到外都具有非常大的药用价值和营养价值。其果皮中含有大量果胶、花青素、膳食纤维等，经过晒干、研磨等工艺处理后可以作为辅料进食，具有一定的保健作用。Queiroz等[1]发现黄色百香果果皮粉（主要是果胶成分）可以降低糖尿病患者的胰岛素抵抗力，改善胰岛素敏感性，从而对糖尿病的常规疗法起到较好的辅助作用。百香果的果肉中存在大量黄酮、黄酮苷、生物碱等小分子化合物，其中的黄酮类成分使百香果具有很好的抗炎作用；
在微量元素方面，百香果果肉中含有铜、钾、铁、钙等21种维持生命活动所必需的矿物质元素，其中钾含量高达1 400~2 640 mg/kg[2]；
除此之外果肉种还存在多种维生素、胡萝卜素等营养物质[3]。
传统的果汁饮品加工灭菌方法多为高温瞬时灭菌或巴氏杀菌，但是高温灭菌容易破坏果浆本身的营养成分，使果汁产生蒸煮味，影响百香果果汁的品质、口感，不利于鲜榨果浆的销售。谢国芳等[4]利用定量描述分析法对高温瞬时灭菌后的蓝莓汁进行感官评定，得出该方法会破坏果浆的天然色泽及香味，还使果浆产生不宜的蒸煮味；
胡盼盼等[5]研究三种传统热杀菌方式处理后鲜榨苹果汁的品质变化，发现果汁中的Vc含量出现了不同程度的下降，其中热处理法对果汁Vc含量的影响最为明显。正因为传统热杀菌方式会对果汁带来不良影响，近年来学者们对非热杀菌工作的研究越来越多，例如彭思嘉等[6]比较了超高压技术和高温短时杀菌技术对樱桃汁品质的影响，结果表明超高压杀菌能有效保持樱桃汁总酚、维生素C、天竺葵素-3,5二葡萄糖苷等营养物质的含量。超高压技术（High Hydrostatic Pressure，HHP）在食品、茶饮品生产加工过程中的影响是近年来的研究热点。将食品或饮品包装后放入舱体中，以液体作为压力传递介质，对其施加 400~600 MPa的压力或用高级液压油施加以100~1 000 MPa的压力并保压一段时间，以杀死食品饮品中的微生物、降低酶活性，达到加工、灭菌、储藏目的[7]。低温等离子体技术（Cold Plasma，CP）是一种新型的非热杀菌技术，其原理是向空气中注入大量能量，使气体电离产生等离子体[8]，这些等离子体受外界电场和磁场的影响，产生多种物理化学反应，如紫外辐射、电磁场、热效应、带电粒子和活性粒子等[9]。这种方式之所以能够灭菌，主要是由于电离出的超氧化物、羟自由基、过氧化氢、一氧化氮和臭氧等活性物质和带电粒子作用于细胞膜及胞内遗传物质，扰乱细胞正常生理功能，从而导致细胞的裂解和死亡。而食品辐照是利用原子能射线产生的辐射能量杀死食品中不同种类的微生物的一种杀菌技术。其原理是利用辐照射线对微生物产生初级和次级作用。除以上三种非热加工方式以外，还有PEF、高压二氧化碳等。
非热处理方法方式均能避免传统热杀菌方式对果浆饮品带来的不良影响，为更好的评估不同非热方式的优点，本文选取百香果榨果浆为对象，选取了方便对液态食品进行杀菌处理的HHP、CP和辐照处理三种方式进行对比研究，设置不同参数处理百香果鲜榨果浆，比较三种杀菌方式的杀菌效果及理化品质的影响，得出杀菌效果最好且对鲜榨果浆品质影响最小的杀菌方法，为其工业化加工和推广提供一定的参考。
1.1 材料与仪器
百香果鲜榨果浆，由广州市领航食品有限公司提供。琼脂粉、胰蛋白胨、酵母浸出膏、氯化钠、无水葡萄糖、磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、孟加拉红琼脂、愈创木酚、30% H2O2，均为分析纯。
SSH-75L超高压设备，三水河科技股份公司；
CPS-Ⅰ型高压电场低温等离子体杀菌测试系统，南京农业大学联合研发；
Q(H)γ型辐照装置，广州辐锐高能技术有限公司；
FD-5荧光分光密度计，SPECTROPHTOMETER；
HY102ATC型手持折光仪，杭州恒仪仪表科技有限公司；
752N型紫外可见光分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；
离心机，广州市泉宏科学仪器有限公司；
LHS-250SC型恒温培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司；
PHS-25型PH计，雷磁；
FA1204C型分析天平，Techcomp；
YX-24JM 型手提式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 超高压处理
使用超高压设备对百香果鲜榨果浆进行杀菌处理。超高压前，将果浆分装在密封袋中真空密封，每袋约50 g，设置处理压力为200、300、400、500、600 MPa，保压时间15 min。每个压力梯度处理4包样品，处理完后于立刻置于-20 ℃冰柜中冷冻储存待测。
1.2.2 低温等离子体处理
使用高压电场低温等离子体冷杀菌设备（CP-I型）对百香果果浆进行杀菌处理。处理时首先控制电压为140 kV，分别对果浆进行时长为3 min、6 min、9 min的杀菌处理；
再控制杀菌时间为6 min，分别用120 kV、160 kV电压对果浆进行杀菌。
1.2.3 辐照处理
利用辐照装置对果浆样品进行杀菌处理，辐射源为钴-60。分别用3 kGy、6 kGy和9 kGy三个梯度处理果浆样品，辐照时长分别为4 h、8 h、12 h。
1.2.4 微生物测定
菌落总数参照国家标准《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》（GB 4789.2-2016），测定三种非热杀菌方式处理前后样品中的菌落总数，以lg(CFU/g)进行计算。霉菌和酵母参照国家标准《食品安全国家标准食品微生物学检验，霉菌和酵母计数测定》（GB 4789.15-2016），测定样品中的霉菌和酵母含量，以lg(CFU/g)进行计算。
1.2.5 酶活性检测
1.2.5.1 POD酶活性检测
粗酶提取液：参照 Carmen[10]的方法略做修改。POD酶活性测定：将粗酶提取液0.1 mL加入比色皿中，再加入反应溶液（含pH值6.1的磷酸缓冲液、30%H2O2和愈创木酚），快速搅拌均匀后放入波长为470 nm的紫外分光光度计中读数。根据读数绘制酶活性图，并计算百香果果浆中的酶活性及残留酶活性，计算公式见公式（1）：
式中：
B——POD酶活性，U/g·min；
∆A470nm——反应时间内吸光度的变化；
Vt——粗酶提取液的总体积，mL；
m——样品鲜重，g；
Vs——测定时取用酶液的体积，mL；
t表示反应时间，min。
1.2.5.2 PPO酶活性检测
粗酶提取液；
参照Carmen[10]方法略做修改。PPO酶活性测定：将粗酶提取液0.3 mL加入比色皿中，再加入3 mL含0.07 mol/L邻苯二酚的磷酸缓冲液（pH值6.5，0.05 mol/L）快速搅拌均匀后于波长为420 nm的紫外分光光度计中读数。根据读数绘制酶活性图，并计算处理后百香果果汁中的酶活性及残留酶活性，计算公式见公式（2）
式中：
C——残留酶活性，%；
At表示处理后果浆中的酶活性，U/g·min；
A0表示处理前果浆的酶活性，U/g·min。
1.2.6 颜色指标检测
利用荧光分光密度计测量百香果果浆的颜色指标。测量前用滤网将果浆中的黑色果籽滤去，并将汁液搅拌均匀，倒入透明塑料测试皿中，在反射模式下读取样品L*、a*、b*三色值，并计算总色差ΔE，重复测量10次取平均值。其中L*示亮度，a*表示被测样品的红绿色，b*表示被测样品的黄蓝色，ΔE为总色差，其值越大，表示样品的颜色变化越大。
1.2.7 pH值与可溶性固型物含量（TSS）
果浆pH值采用pH计测定仪检测。取10 mL样品于烧杯中，放置到温度恢复至室温后，搅拌均匀，用pH计进行测定，每个样品测量5次，取平均值。
采用手持式折光计法测定果浆中的TSS含量。将样品液搅拌均匀后，用吸管吸取2~3滴样品液于棱镜上通过目镜观察读数。每个样品重复5次，取平均值。
1.2.8 果浆贮藏期实验
选取综合评价较好的处理方式处理百香果果浆后进行贮藏期实验。在-20 ℃下保存时间达到1周、2周、1月、2月、3月、6月、9月时，对处理前后样品的微生物含量进行测试。
1.3 数据统计与分析
采用SPSS对实验数据进行分析，运用Origin 19.0软件进行绘图。
2.1 微生物情况
菌落数是判定果汁饮品被污染程度的主要标志，其测定结果能反映果浆在生产过程中是否达到卫生标准、灭菌是否充分，以便做出适当的卫生学评价。经测定并比较三种杀菌方法以及未经杀菌的百香果果浆微生物指标，结果如表1所示：三种杀菌方式处理前百香果果浆中测出的初始自然菌落数分别为2.15 lg(CFU/g)、2.44 lg(CFU/g)和 2.54 lg(CFU/g)，经过 200 MPa超高压处理后，果浆中的菌落总数降至2.021 lg(CFU/g)。根据《食品安全国家标准饮品》（GB 7101-2015）中的规定，果汁饮料中自然菌落数需≤2 lg(CFU/g)，因此200 MPa压力处理并不能达到良好的杀菌效果；
300 MPa及以上压力处理后，果浆样品的菌落总数已降至可检测值以下（≤1 lg(CFU/g)），这些结果说明 HHP处理能有效抑制甚至杀灭百香果果浆中不耐压的自然菌，且压力越高杀菌效果越明显。同样地，辐照处理也能有效杀灭果浆中的微生物，3 kGy辐射量处理后百香果果浆的微生物含量已经降至可检测值以下。
表1 三种杀菌方式对百香果果浆菌落总数的影响Table 1 Effects of three sterilization methods on the total number of colonies in passion fruit pulp
CP处理对百香果果浆中的微生物同样表现出一定的抑制作用，但效果较 HHP处理和辐照处理不显著，具体表现为：在相同的处理电压下（140 kV），处理6 min才能将果浆中的菌落总数降至国标要求的安全值以下，且随着处理时间的延长，9 min后果浆中的菌落数仍有1.65 lg(CFU/g)，杀菌率为32.37%；
而在相同的处理时间下（6 min），果浆中的菌落数随着处理电压的升高出现小幅度下降，但用160 kV电压处理果浆后，菌落总数仍有1.87 lg(CFU/g）。
霉菌和酵母菌时引起果汁原浆腐败的重要菌类之一，其中以青霉最为常见。它的存在会导致水果原浆产生刺激性气味，也会使果汁分层，严重影响果汁的品质和观感。而不少霉菌又属于耐热型菌种，常规的巴氏消毒可能无法完将其全杀灭，因此研究非热杀菌技术对霉菌的杀灭效果尤为重要。三种不同的杀菌处理后百香果果浆中霉菌和酵母的含量如表2所示。三种杀菌方式都能完全杀灭果浆中的霉菌和酵母，其中HHP处理和辐照处理效果尤为显著，具体表现为：300 MPa及以上压力处理后的果浆已经无法检测出霉菌和酵母；
在辐照处理方面，3 kGy辐射量处理后即可达到100%灭菌。对于CP处理，用160 kV电压处理6 min或140 kV电压处理9 min，才能将果浆中的霉菌完全杀灭。
表2 三种杀菌方式对百香果果浆霉菌和酵母的影响Table 2 Effects of three sterilization methods on passion fruit pulp mold and yeast
总的来说，以上三种不同的非热杀菌技术中HHP处理和辐照处理均有较好的杀菌效果，而CP处理的杀菌效果则不占优势。这是因为 HHP技术杀菌的基本原理是基于压力对微生物的致死作用，一定程度的高压会影响微生物细胞的形态和结构，影响其内部的生物化学反应，同时还会破坏细胞膜、细胞壁等结构，甚至会导致细胞内容物泄漏，对一些微生物造成不可逆的变化[11]；
辐照杀菌的原理基于射线对微生物的初级作用和次级作用，Co-60等辐射源可以破坏微生物的DNA并使细胞内的酶、膜蛋白变性，从而导致细胞失活[12]。以上两种方式均可以直接作用于微生物上，因而杀菌效果更优；
而低温等离子体杀菌技术主要利用样品周围的介质放电产生光电子、离子和自由基等活性物质，从而对样品中的微生物产生抑制作用[13]。低温等离子体技术较为复杂，杀菌效果受到多种因素的影响，且在杀菌时样品包装内部需要留出足够的空间（约占包装的 1/3），因而限制了装样体积。此外，辐照处理虽然可以达到理想的杀菌效果，但由于该技术处理后的食品可能会存在辐射残留，这会对人体健康造成一定的损害，目前多数消费者对辐照杀菌食品的接受程度不高。因此可以判断在以上三种非热杀菌方式中，超高压同时具备了杀菌效果良好且技术安全的特点。为了进一步探究 HHP技术对百香果果浆贮藏期安全性的影响，以及三种非热杀菌技术对果浆样品理化性质的影响，对HHP处理后的样品进行9个月的微生物检测，并且测试了三种杀菌方式处理后样品的酶活性、色泽、pH值等参数的变化。
2.2 贮藏期实验
HHP处理后在-20 ℃下存放9个月期间果浆菌落总数和霉菌数量变化如下图所示。由图1可知，随着储存时间的延长，各处理组的自然菌数量逐渐增加，其中对照组（未经过HHP处理）和200 MPa压力处理组中的微生物数量增长较快，证明果浆中有不少细菌和微生物在200 MPa压力下还能存活；
在-20 ℃条件下储存半年内，400 MPa及以上压力处理的百香果果浆的菌落数仍低于国标中的安全值；
储存到9个月时，400 MPa处理的百香果果浆菌落总数略微超过了国家标准要求的2 lg(CFU/g)，但500~600 MPa处理的果浆菌落数依旧低于2 lg(CFU/g)，达到理想的杀菌效果。由此可见，超高压400 MPa及以上压力处理已经能将大部分不耐压得自然菌杀灭，对于不耐压的细菌也能有效抑制其生长，实现较好的杀菌效果。
图1 百香果储存9个月内菌落总数变化Fig.1 Changes in the total number of colonies of passion fruit within 9 months of storage
贮藏期内百香果果浆的霉菌变化如图2所示：随着储存时间的延长，对照组和200 MPa处理组中检测出的霉菌数量均呈现出上升趋势，300 MPa处理组果浆则分别在60 d、半年和9个月取样时检测出霉菌，且菌落数均低于国标规定的安全值（≤20 CFU/g），因此猜测300 MPa处理组测出的霉菌是由人为操作或培养时落入；
400~600 MPa压力处理后始终没有检测出霉菌，因此可以推测400 MPa以上超高压处理有效杀灭百香果果浆中的霉菌。其他学者的研究中也有类似的结果：Feng等[14]将草莓-苹果-柠檬复合果汁于500 MPa下处理15 min后在冷藏（4 ℃）中储存12 d以上，结果表明超高压处理能保证果汁在储存期内能满足商业无菌标准，且理化性质无显著差异。黄晓铃[15]在常温下用600 MPa的超高压处理NFC橙汁并保压1分钟后测得橙汁中自然菌数量降至检测限值，在4 ℃下储藏25 d后仍未检测出微生物指标，表明经600 MPa超高压处理后NFC橙汁的贮藏期明显延长，储藏期内微生物安全性更高。
图2 百香果储存9个月内霉菌和酵母变化Fig.2 Changes in mold and yeast of passion fruit within 9 months of storage
2.3 酶活性检测
对照组果浆测得POD酶活性和PPO酶活性分别为174.0 U/g·min和3.16 U/g·min。分别用三种非热杀菌方式处理后的百香果果浆中的POD酶及PPO酶残留活性如图3~5所示，可以看出，三种杀菌方式对百香果果浆中的 POD酶活性均有一定的抑制作用。利用 HHP技术处理的果浆，随着处理压力的升高，果浆中的POD酶活性呈现下降的趋势（图3），其中用200 MPa和300 MPa压力处理的样品POD酶活性下降速度缓慢，处理15 min后果浆中的残余酶活性仍有70.07%和69.17%；
往后随着压力的上升，POD酶活性下降较为明显，用600 MPa压力处理后POD酶的残留活性已低于50%。辐照杀菌方式对果浆POD酶活性的影响 HHP处理相似，随着辐照剂量的上升，果浆中 POD酶的残留活性从 81.97%下降至 53.40%（图5）。CP处理方面，不同处理时间和处理电压对POD酶残留活性的影响如图4所示，由图可知，在处理压力不变的情况下（140 kV）POD酶活性随着处理时间的延长而下降；
在处理时间恒定的情况下（6 min），处理电压越大 POD酶的残留活性越小，且在本实验中，用120 kV电压处理样品6 min后果浆的POD酶残留活性最高，因此猜测在一定范围电压强度对酶活性的影响较处理时间大。
图3 HHP处理后百香果果浆POD及PPO酶残留活性Fig.3 Residual activities of POD and PPO enzymes in passion fruit pulp after HHP treatment
图4 CP处理后百香果果浆POD及PPO酶残留活性Fig.4 Residual activities of POD and PPO enzymes in passion fruit pulp after CP treatment
图5 辐照处理后百香果果浆POD及PPO酶残留活性Fig.5 Residual activities of POD and PPO enzymes in passion fruit pulp after irradiation treatment
PPO酶也是促进水果褐变的关键酶之一，在一定条件下，PPO酶会将水果中的酚类物质催化为醌并聚合成黑色素或褐色素[16]，导致果肉颜色改变，因此控制PPO酶的活性有助于延缓果浆褐变，保持色泽。对于PPO酶的残余酶活性，HHP处理和CP处理对PPO酶活性的影响与POD酶类似，随着处理参数的改变，PPO酶残留活性的变化呈现出与POD酶相同的趋势，但从整体上来看，CP处理对PPO酶的钝化作用没有POD酶显著。而经过辐照处理后果浆中PPO酶的活性呈现出与POD酶相反的趋势：3 kGy辐照量处理后，果浆中的PPO酶被激活，活性由对照组的3.16 U/g·min上升至3.54 U/g·min，且辐照剂量越大样品中PPO酶的活性越高，处理组与对照组存在明显差异（p＜0.05）。
2.4 颜色指标
三种方式处理后百香果果浆的色泽如表3所示。由于测试时百香果果浆中籽的数量会对色泽产生较大的影响，且三种处理方式均不会对果籽的色泽、形态造成明显变化，因此本次实验中先将果浆中的果籽滤去，再用荧光分光密度计测量果浆的色度值。为了研究三种非热处理方式对百香果果浆色泽的影响，处理后的样品均在-20 ℃下存放了两周后进行测量。由表3可得，超高压处理和低温等离子体处理后果浆的ΔE值均小于1。一般认为当ΔE≥2时，色泽差别可以被人的视觉所分辨，当ΔE＜2时，色泽变化肉眼不可分辨[17]，因此超高压处理和低温等离子体处理不会对果浆的色泽产生明显影响，不会使果浆发生肉眼可分辨的颜色变化，这与于弘慧等[18]在探究CP杀菌工艺对梨汁品质的影响时得出的结果一致。辐照处理后百香果果浆的色差存在显著差异，随着辐照剂量的增加果浆的总色差ΔE值增大，其变化趋势与辐照处理后PPO酶活性的变化趋势一致。由表3可以看出，对照组果浆的L*值为2.03，3 kGy辐照处理后L*值下降至1.82，L*值的下降代表果浆颜色变暗，6 kGy和9 kGy辐照量处理后果浆的L*、a*、b*值进一步下降，9 kGy时b*值从对照组的1.84降至0.64，以上数据均表明辐照处理会导致果浆的颜色加深，从图6也可看出9 kGy辐照处理后百香果样品的色泽偏暗，以上数据进一步佐证了辐照处理对果浆PPO酶的激活作用。
图6 不同辐照剂量处理后百香果果浆色泽变化Fig.6 Color change of passion fruit pulp after different irradiation doses
表3 三种方式处理后百香果果浆的色差Table 3 The color difference of passion fruit pulp after treatment in three treatments
2.5 pH值和可溶性固形物含量（TSS）
果汁pH值的大小会直接影响果汁的滋味和口感，由表4可知，三种杀菌方式处理后百香果果浆的pH值与对照组相比，pH值和无显著差异，数值维持在pH值3.13~3.16范围内，证明三种处理方式对果浆的pH值影响甚微。在可溶性固形物含量检测方面，对照组果浆的可溶性固形物含量为 15.2 °Brix，而经过200~600 MPa超高压后，样品的可溶性固形物含量均有略微上升，数值分布在15.5~17.0 °Brix之间，而CP和辐照两种杀菌方式处理后果浆中的TSS含量维持在15.2 °Brix，并未发生明显变化，分析认为有可能是超高压会使果汁中一些大分子物质破裂蛋白质溶出，从而导致了可溶性固形物含量的升高。相关文献也有类似的结果，如邓红等[19]利用超高压技术处理猕猴桃NFC果汁，结果发现处理后猕猴桃汁的TSS含量也出现了略微上升。但从总体上来看，三种杀菌方式处理后百香果果浆的pH值及TSS值均在小范围内变化，说明以上三种方式对果浆的pH值及TSS影响较小。
表4 三种方式处理后百香果果浆的pH值和可溶性固形物含量Table 4 pH value and TSS content of passion fruit pulp after three treatments
本文研究HHP、CP和辐照处理对百香果果浆的影响，分析了处理前后果浆的微生物数量、残留酶活性、色泽、pH值及TSS的变化。结果表明，三种杀菌方式均能使百香果鲜榨果浆达到商业无菌的要求，其中 HHP和辐照处理的杀菌效果更好，具体表现为300 MPa及以上压力处理（保压时间15 min）和3 kGy及以上辐照量处理即可将百香果果浆中的菌落数降至小于2 lg(CFU/g)，且利用HHP技术处理的果浆经过9个月的储存期实验后，500 MPa和600 MPa处理后果浆的微生物数量仍低于国标要求的安全值。在理化性质方面，三种杀菌方式对百香果果浆pH和TSS的影响较小，与对照组样品的差异不显著（p＞0.05）。不同杀菌方式均会引起果浆L*、a*、b*值的变化，其中CP技术处理后果浆的总色差变化最小，HHP处理后的色差值略大于CP技术，但两者都不会对果浆的色泽造成肉眼可见的明显变化（ΔE＜2）；
而辐照后的样品与对照组相比由于 PPO酶活性有明显上升（p＜0.05），且在实验中随着辐照剂量的增加，PPO酶活性从 3.16 U/g·min 上升至 5.28 U/g·min，因此处理后的样品更容易褐变，9 kGy辐照量处理后的样品与对照组相比色差值ΔE已大于2，说明果浆色泽发生肉眼可辨的改变。综合得，HHP技术在杀菌和保持理化性质方面的整体表现较为优秀。其他学者在研究超高压蔬果汁的影响时也有类似的结论，如 Qing等[20]研究表明400 MPa超高压处理能有效杀灭西瓜汁中的微生物，且可以保持西瓜汁在贮藏期（16周）内的品质和风味。综上所述，HHP技术在果蔬汁加工行业中具有广阔的应用前景。