林 珊 屈思萌 张 荣 王生海 韦秋红Δ
（1 保定市第一中心医院眼一科，2 河北大学附属医院ICU重症医学科，保定 071000）
视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）是全世界儿童中最常见的眼内肿瘤，尽管尽早发现可治愈，但在发展中国家Rb死亡率高达70%[1]。尽管在放射疗法和化学疗法以及手术切除治疗Rb方面取得了进步，但晚期Rb很难治疗，因为Rb可以迅速填充眼睛，侵入视神经，并最终扩散到中枢神经系统，从而致命[2]。因此，迫切需要开发用于治疗Rb新的药物。藏红花素（Crocin）是鸢尾科番红花属球根类草本植物藏红花中提取的一种水溶性类胡萝卜素。相关研究表明藏红花素具有较强的抗肿瘤活性，可抑制肿瘤的生长和扩散，包括结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨髓癌和白血病[3-9]，这表明它可以作为癌症化疗和癌症预防剂。本研究旨在探究藏红花素对Rb自噬、凋亡、侵袭和PI3K/AKT活化的影响，以期为藏红花素应用于Rb的治疗提供理论和实验依据。
1.1 实验药物和主要试剂
藏红花素购自美国Sigma-Aldrich，化学式为C44H64O24，分子量976.96；
Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI 1640）培养基、胎牛血清、青-链霉素、胰蛋白酶购自美国Gibco 公司；
Transwell购自美国Corning Costar；
CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、免疫荧光染色试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；
兔抗LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin1、ATG7、PI3K、p-PI3K、AKT（ab106693）、p-AKT、GAPDH单克隆抗体购自英国Abcam公司。
1.2 细胞培养
人Rb细胞Y79来源于美国典型培养物保藏中心，将细胞培养于RPMI1640培养基中，添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，置于37℃含5%CO2的培养箱中培养，每24 h更换新鲜培养基，1：2传代。选用对数生长期细胞为实验用细胞。
1.3 CCK-8
将Rb细胞Y79接种于96孔板（100 μL/孔）孵育24 h后，用不同剂量（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmoL/L）藏红花素处理细胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h，在450 nm处用酶标仪测定OD值。
1.4 细胞分组及处理
通过方法1.3结果计算藏红花素对人Rb细胞Y79的IC50值，选择无显著毒性1、2、4 μmoL/L剂量藏红花素处理Y79细胞48 h，并选择0 μmoL/L剂量藏红花素作为对照组，将细胞分为4组：对照组、藏红花素1 μmoL/L组、藏红花素2 μmoL/L组和藏红花素4 μmoL/L组。
1.5 免疫荧光
将爬片用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗15 min，用0.1 % Triton X-100通透5 min，用5 %牛血清白蛋白（BSA）在PBS中培养30 min，滴加LC3（1∶100）或AKT（1∶100）一抗，4℃孵育过夜，清洗后，加入FITC标记荧光二抗（1∶1 000）孵育2 h，最后加入DAPI染色避光孵育1 h。清洗后用抗荧光淬灭剂封片。在荧光显微镜下观察，并采集图片，每个细胞的绿色荧光斑点数量通过用斑点数除以每个场中的细胞核数来确定。
1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡
采用Annexin V-FITC和PI双重染色检测细胞凋亡。收集各组Y79悬浮细胞到10 mL的离心管中，每样本细胞数为3×106/mL， 1 000 r/min离心5 min，弃去培养液，用孵育缓冲液洗涤1次，1 000 r/min离心5 min，重悬细胞后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI溶液室温避光孵育15 min，1 000 r/min离心5 min，将细胞悬浮在结合缓冲液中，采用流式细胞仪分析。右上象限（晚期凋亡）和右下象限（早期凋亡）中的Y79细胞是凋亡细胞。
1.7 Transwell检测细胞迁移
Transwell小室加入50 μL基质胶并于37℃孵育3 h凝固。将1.4所述的方法分组及处理的细胞接种于Transwell小室上室，其中上室为无血清培养基，下室为完全培养基，培养48 h后取出小室，擦除未过膜的细胞后多聚甲醛固定，1%结晶紫染色后拍照。每组取3个随机视野，计数视野中的染色细胞数目即为侵袭细胞数。
1.8 免疫印迹检测
收集各组细胞加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，用BCA试剂盒测定蛋白质含量。提取等量的蛋白质样品，在100℃条件下变性5 min。然后使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离并转移至聚偏氟乙烯膜，在4℃条件下加入LC3（1∶3 000）、Beclin1（1∶2 000）、ATG7（1∶3 000）、PI3K（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）并孵育过夜，清洗，然后在4℃下加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000），孵育2 h，最后加入发光液，曝光处理。Image J软件统计灰度值。
1.9 统计学处理
应用SPSS 18.0软件对实验数据进行统计学分析。数据以±s表示，两组间比较采取t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 藏红花素降低Y79细胞活力
通过CCK-8法检测不同剂量藏红花素对Y79细胞活力的影响，与0.125 μmoL/L组相比较，2、4、8、16 μmoL/L组细胞存活率显著降低（P＜0.05）（图1）。
图1 藏红花素对Y79细胞存活率的影响
2.2 藏红花素升高Y79细胞LC3含量
通过免疫荧光检测LC3含量结果，与对照组相比较，Crocin 2、4 μmol/L组细胞LC3含量显著升高（P＜0.05）（图2）。
图2 藏红花素对Y79细胞LC3含量的影响，×200。A～D：免疫荧光染色；
A：对照组；
B：藏红花素1 μmol/L组；
C：藏红花素2 μmol/L组；
D：藏红花素4 μmol/L组；
E：各组LC3比较。*P＜0.05 vs 对照组.
2.3 藏红花素升高Y79细胞LC3II/LC3I比值，降低ATG7蛋白表达水平
免疫印迹检测各组细胞LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1、ATG7蛋白表达水平，与对照组相比较，Crocin 2、4 μmoL/L组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高（P＜0.05），Beclin1、ATG7蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）（图3）。
图3 藏红花素对Y79细胞LC3I、LC3II、Beclin1、ATG7蛋白表达水平的影响
2.4 藏红花素促进Y79细胞凋亡
通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡，与对照组相比较，Crocin 2、4 μmol/L组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）（图4）。
图4 流式细胞术检测藏红花素对Y79细胞凋亡的影响
2.5 藏红花素抑制Y79细胞侵袭
与对照组相比较，藏红花素2、4 μmol/L组侵袭细胞数显著降低（P＜0.05）（图5）。
图5 藏红花素对Y79细胞侵袭细胞数的影响，×200。A～D：Transwell检测细胞侵袭；
A：对照组；
B：藏红花素1 μmol/L；
C：藏红花素2 μmol/L；
D：藏红花素4 μmol/L；
E：各组侵袭细胞数目比较，*P＜0.05 vs 对照组.
2.6 藏红花素降低Y79细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值及AKT核转位
通过免疫印迹检测各组细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平结果如图6A所示，与对照组相比较，藏红花素2、4 μmoL/L组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值显著降低（P＜0.05）；
免疫荧光检测AKT的细胞核转位情况结果如图6C所示，与对照组相比较，藏红花素2、4 μmoL/L组AKT核转位显著降低（P＜0.05）。
图6 藏红花素对Y79细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平和AKT核转位的影响，×200。A：免疫印迹检测PI3K和AKT蛋白的磷酸化；
B：蛋白相对表达水平；
C～F：免疫荧光检测AKT的表达；
C：对照组；
D：藏红花素1 μmol/L；
E：藏红花素2 μmol/L；
F：藏红花素4 μmol/L；
G：各组AKT核转位的比较，*P＜0.05 vs 对照组.
Rb是源自未成熟视网膜细胞的眼内恶性肿瘤，目前用于Rb治疗的策略有限，包括手术切除、放疗和全身化学疗法[10]，因此，需要新的疗法和治疗策略来改善Rb患者的预后。植物类药物在中医治疗疾病中发挥着重要作用，植物类药物及提取物因其作用温和、疗效显著、副作用轻，因而广泛用于许多疾病的治疗。本研究通过CCK-8法实验结果表明，藏红花素具有降低Y79细胞活力的作用。提示藏红花素可能对Rb具有抗肿瘤活性。
本研究结果显示，经藏红花素处理后， Y79细胞LC3含量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高， ATG7蛋白表达水平降低。自噬是一种主要的细胞内降解过程，发生在细胞遭受某些应激条件时，可抑制某些癌细胞的生长[11]。自噬蛋白LC3可分为LC3Ⅰ和LC3Ⅱ2种，LC3Ⅱ定位在双层膜和自噬体上，是自噬体的特异性标志分子，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值与自噬泡的数量呈正相关，其比值大小是判定自噬水平高低的依据[12]。Beclin1基因，可作为抑癌基因参与大部分恶性肿瘤的发生发展，在 Rb中表达下调可降低细胞自噬能力，增加肿瘤发生的概率[13]。ATG7是自噬调节的重要蛋白，可通过调节多种酶的活性从而激活细胞的自噬及凋亡过程[14]。骆玉霜等[15]研究发现藏红花素联合顺铂可能下调LC3Ⅱ和ATG7表达，提高对BGC-823细胞的生长抑制作用。Zeng等[16]研究显示藏红花素通过调节自噬活性状态，起到保护心肌细胞的功效。本研究与上述研究结果一致，说明藏红花素可抑制Y79细胞自噬。
本研究通过流式和Transwell实验结果显示，经藏红花素处理后，Y79细胞凋亡率升高，侵袭细胞数降低。相关研究表明，药物过度诱导自噬可导致肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤效应[17]。细胞凋亡属于机体对自身稳定性进行调节的一种机制，提高肿瘤细胞凋亡率，是多种抗肿瘤药物及抗癌基因作用的典型特征。Rb的恶性程度极高，防治Rb侵袭对于控制肿瘤、提高治愈率及延长患者生存具有重要意义。刘柏林等[17]研究表明藏红花素可诱导人胰腺癌HPAC细胞凋亡，李媛等[18]研究表明藏红花素可抑制黑色素瘤A375细胞的侵袭与迁移。说明藏红花素具有促进Y79细胞凋亡，降低细胞侵袭能力的作用。
磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/Serine/threonine kinase，PI3K/AKT）信号通路在炎症反应和各种肿瘤细胞中发挥重要作用，其表达异常可导致肿瘤的发生和发展[19]。相关研究表明，PI3K/AKT信号通路在Rb中表达异常，可参与调控肿瘤细胞生长、凋亡等过程[20]。Gui等[21]研究表明，抑制PI3K/AKT信号通路可降低Rb的增殖及诱导细胞的凋亡。Qi 等[22]研究显示藏红花素可以通过PI3K/AKT信号通路阻止视网膜缺血性损伤导致的视网膜神经节细胞凋亡。本研究结果表明，藏红花素具有降低Y79细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值及AKT核转位的作用，提示藏红花素抑制PI3K/AKT信号通路。
综上所述，藏红花素诱导Y79细胞凋亡和自噬，抑制细胞侵袭，这可能是通过抑制PI3K/AKT活化实现。然而Rb细胞凋亡、自噬和侵袭机制较复杂，是否还通过其他通路发挥作用，还有待于后续深入研究。
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