陈楚翘，刘振民，喻东威，徐斐，袁敏
(1.上海食品快速检测工程技术研究中心 上海理工大学 健康科学与工程学院，上海 200093；
2.光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436；
3.内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 011500)
生物胺(BA)是在动植物和微生物代谢过程中形成的低分子含氮化合物[1]。低浓度的生物胺与多种人体生理功能相关，例如胃酸分泌和调节核酸与蛋白质，但过量摄入会引发不良的生理反应，严重时还会危及生命[2]。生物胺广泛存在于天然食物中，但由于不同种类食品中的微生物分布迥异，导致生物胺种类和数量的差异，同时食品发酵及储存过程会造成不同程度的生物胺累积。因此监测食品生产过程中生物胺含量的变化可以作为评价食品品质和新鲜度的重要指标[3]。由于食品中基质成分复杂，容易对生物胺的含量分析造成干扰。根据生物胺分析方法的技术需求，必须在检测前对生物胺样品进行前处理，利用合适的前处理方法进行样品净化或富集[4-5]，以获得良好的生物胺提取效率。本文对食品中主要存在的生物胺种类以及生物胺样品前处理技术的最新进展进行了概述。
生物胺广泛存在于富含蛋白质的食品中。肉制品中丰富的蛋白质经降解后产生的大量游离氨基酸，在氨基酸脱羧酶作用下导致生物胺大量生成。肉制品中主要存在的生物胺种类有精胺、亚精胺、酪胺等[6-7]。同样的，由于水产制品极适合微生物繁殖且含有大量易降解的蛋白质，故而极易造成生物胺含量超标，水产制品中主要存在的生物胺为组胺、腐胺、尸胺等[8-9]。酒类中的生物胺主要存在的生物胺为腐胺、组胺、酪胺等[10-11]，其总含量虽一般低于水产制品，但其中含有的乙醇会增加生物胺的毒性，故而也是食品安全领域关注的重点。深受人们青睐的奶酪，因其中富含大量酪氨酸，在发酵加工和成熟贮存过程极易产生大量酪胺[12-14]，同样也是食品检测的重点对象。
由于生物胺具有潜在毒性，准确快速测定生物胺含量成为了食品安全环节不可忽视的内容。然而食品中生物胺的检测较为困难，主要原因在于；
①食品基质复杂：人们所喜爱的发酵食品、肉类、水产类食品给生物胺形成提供了理想环境，同时这类食品富含蛋白质和脂肪为生物胺检测增加了难度。检测基质复杂的样品，需要经过提取、净化等步骤，从而得到准确测定生物胺的含量；
②常用的检测方法所结合的前处理步骤繁琐：生物胺既无荧光特性，也无紫外吸收基团，故而无法通过紫外或荧光仪进行检测，因此生物胺检测方法主要是色谱法，例如高效液相色谱(HPLC)[15]、气相色谱-质谱分析(GC-MS)[16]等，但提取得到的样品还需经过衍生化前处理后才能分析。其他方法诸如毛细管电泳及生物传感器法[17]等可以省略衍生化步骤而直接分析生物胺含量。但毛细管电泳法对样品的纯度要求高，只适用于酒类等基质简单样品中生物胺含量的测定。经典前处理方法例如液液萃取通常使用有机溶剂提取生物胺，有机溶剂会导致酶失活，故而也无法联用以酶等作为生物探针来对生物胺分析的生物传感器检测法。因此发展新型的前处理方法对于提高生物胺的检测能力极为重要。近年来随着绿色分析技术的发展，许多新型前处理方法不断涌现。本文对近年来生物胺的前处理方法进行简要概述。
2.1 液相萃取
2.1.1 液液萃取 液液萃取是根据目标待测物质的溶解度差异，从而达到分离纯化的前处理方法。液液萃取是国内外提取生物胺的公认方法，在生物胺的测定国标[18]中用正丁醇/三氯甲烷混合试剂萃取生物胺，高效液相色谱法定量分析。虽然该方法适用于大部分食品，检测结果准确，但步骤极为繁琐，整个前处理过程耗时4 h以上。部分学者在液液萃取的基础上对其进行了改进。Francisco等[19]采用盐析辅助液液萃取技术净化酸奶中的生物胺，加入硫酸铵进行盐析反应，加速向有机相转移，缩短了萃取时间，获得了较高的提取回收率。传统液液萃取多消耗大量高毒有机溶剂[20]，无法与绿色新型检测方法联用，而与色谱技术联用又需进行衍生化处理，时间冗长。随着近年来样品处理技术的不断发展，液液萃取逐渐克服有机溶剂消耗量大、操作复杂的缺点，许多新技术基于液液萃取的原理不断涌现。
2.2 固相萃取
2.2.1 传统固相萃取 固相萃取是提取食品中生物胺的常用方法之一[24]。其原理是取用选择性强的固体吸附剂例如十八烷基、石墨碳、苯基等来吸附复杂基质中的待测化合物，使其达到与杂质分离的效果，随后通过加热或者洗脱液洗脱解除吸附，从而实现净化与富集样品的目的。Liu等[25]建立了固相萃取-高效液相色谱法测定奶酪和香肠中的6种生物胺，先使用盐酸和高氯酸提取奶酪和香肠中的生物胺，然后采用Oasis®MCX cartridge固相萃取柱对提取物进行净化，随后进行色谱检测。该方法中奶酪生物胺回收率达到91.0%～99.1%，香肠中生物胺回收率达到90.3%～95.4%，较好地实现了富含蛋白质和脂肪的食品中生物胺的分离。相较于液液萃取，固相萃取无需选择两种不相溶的试剂，也不会产生乳化现象，但萃取效率会伴随着固相萃取材料的使用次数增加而下降。因而需要发展更高效、具有特异性的填料。
2.2.2 分子印迹固相萃取 分子印迹固相萃取[26]是在固相萃取基础上发展而来的新型萃取技术，以印迹聚合物(MIP)为填料，解决了传统萃取材料特异性能差等缺点，且聚合物制备简单，重复利用率高。Li等[27]首次将分子印迹固相萃取与丝网印刷电极检测技术联用来检测血清和牛奶中的酪胺，以酪胺为模板分子制备印迹聚合物，在电极上涂层修饰MIP进行检测，得到牛奶中的酪胺回收率为 99.6%～102.4%，对酪胺具有强选择性，满足检测需求。然而分子印迹技术依然存在不足，主要问题在于印迹聚合物在水环境下的选择能力较差，水相萃取效果差。目前的解决方向主要集中于：①多步萃取，避开水相萃取；
②用有机溶剂在填料表面形成有机物保护壳，从而保护具有识别功能的官能团，增强水相萃取能力。
随着分子印迹固相萃取技术的不断发展，许多新模式分子固相萃取应运而生，例如磁性分子印迹聚合物微球萃取技术、分子印迹基质固相分散萃取等，其可能成为未来最具发展潜力的前处理技术之一。
2.2.3 固相微萃取 固相微萃取与固相萃取原理相似，但样品的前处理操作有很大差异。微萃取是集采样、萃取、浓缩、进样于一体的无溶剂处理技术，基于不同涂层材料的纤维或金属丝来达到萃取、浓缩样品中待测物质的目的。整个过程包括吸附和解吸两步。具有涂层材料的金属丝或萃取纤维首先在适当溶剂中进行探针的活化以去除表面杂质，随后将探针放入样品中萃取目标物，萃取完成后将探针放入水等溶剂中冲洗去吸附层表面的干扰物，最后吸附目标物质的探针直接插入气相等仪器的进样口进行测定。Papageorgiou等[28]优化了固相微萃取过程中的萃取纤维类型、提取时间、解吸过程、pH等因素，实验结果表明该方法完全满足葡萄酒产业中的生物胺分析。整个过程中固相微萃取无需有机溶剂，对环境危害程度小，但目前发展过程中固相微萃取仍存在以下问题：①纤维萃取针头脆弱易断且无法多次使用，杂质容易在上面吸附影响提取效果；
②萃取纤维造价昂贵，目前可以商品化的纤维屈指可数，限制了日常应用，故而固相微萃取技术仍需在萃取纤维方面进行深度优化研究，未来随着性能更佳、成本更合理的萃取纤维头的出现，必将提高固相微萃取应用过程中的稳定性和使用重复性。
2.2.4 基质辅助固相分散萃取 基质辅助固相分散萃取与传统样品前处理方式不同，样品的提取及净化流程是同时进行的。分散剂例如硅藻土、硅胶、C18等与粉碎后的固体样品碾磨充分，随后作为填料装柱，在淋洗剂的作用下实现目标物质的分离，具备同时分析多种样品、平衡时间短、萃取效率高等优点。Milheiro等[29]采用基质固相分散萃取技术净化富集酒类样品中的生物胺，该法向样品中加入Dowex®50W X8吸附剂，随后采用氢氧化钠溶液洗脱，结果表明该法能准确测定对133～509 μg/L内的生物胺。基质辅助固相分散无需进行离心、过滤等操作，在一定程度上避免了样品的损失。但该方法不易进行广泛推广，主要受制于人为因素导致填装技术的差异及研磨的颗粒大小不同。
2.2.5 吸附分离 吸附提取是一种低能耗的固相萃取技术，利用一些高分子聚合材料吸附干扰物质从而实现目标物质的纯化。聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，因其呈多孔不规则团块状，比表面积与微孔面积大，吸附能力强，常被用来处理基质简单的液体样品。Daniel等[30]建立了一种PVPP吸附结合毛细管电泳-质谱的检测方法，测定酒类样品中的多种生物胺，首先将PVPP(0.5 g)与酒类样品(10 mL)混合，均质离心处理后再通过0.45 μm再生纤维素膜(Agilent P/N 5190-5284)进一步除去干扰物，随后进行分析测定。该方法对生物胺的回收率达到了87%～113%，检测限低至1～2 μg/L，适用于酒类样品中生物胺的检测需求。PVPP吸附处理时间基本能控制在10 min以内，操作步骤简单，满足绿色检测需求，但PVPP应用领域较窄，多用于吸附多酚物质，对其他干扰物质的吸附率较低。未来吸附提取发展趋势将是根据待测物的结构开发出更多高效的吸附剂，从而实现对不同物质的净化。
2.3 电膜萃取
与传统消耗大量有机溶剂的前处理方法不同，Pedersen-Bjergaard等[31]在2006年提出的电膜萃取前处理方法，可以大量减少甚至避免有机溶剂的使用。电膜萃取是以电场为驱动力的萃取手段，使用酸碱等试剂调节pH使目标物以离子形式存在，带电目标物质在电场驱动下通过有机溶剂形成的极薄支撑液膜(SLM)到达接受相溶液，从而实现样品的净化与富集，原理见图1。Zarghampour等[32]使用芯片电膜萃取技术净化富集香肠中的生物胺，前处理过程仅需30 min，提取回收率>95%，完全满足食品中生物胺的检测需求。目前许多学者将电膜萃取与其他前处理方法联用，弥补单一前处理技术的不足。Kamankesh等[33]建立了电膜萃取与液液微萃取相结合的前处理方法，样品经电膜萃取后再经液液微萃取，有机溶剂需求量极低，符合绿色检测的要求。该法高效、快速，富集倍数高，最终提取回收率达到82%～99%。
电膜萃取作为一种微型化萃取方法，对于基质复杂的样品具有显著的富集纯化效果，同时装置容易制备，所需样品和溶剂的量都以μL计，是一种环境友好型的检测方法。但目前仍受限于SLM的不稳定性，萃取效率在一定范围内与电压呈正相关，但SLM可能会在高电压的情况受热脱落，导致实验失败。因此，对于不同目标物质，寻找适宜、稳定的SLM至关重要。未来的电膜萃取趋势也将是发展更稳定的新型SLM，从而给样品分析带来更多新选择。
图1 电膜萃取过程示意图Fig.1 Schematic diagram of electromembrane extraction
前处理方法是生物胺检测过程中不可或缺的过程，传统液液萃取作为最常用的生物胺处理方法，存在有机溶剂消耗量大、易发生乳化现象等缺点，固相萃取可以避免乳化现象的发生，但萃取材料无法多次使用。电膜萃取可应用于不同的基质，并且解决了后续检测技术不兼容的问题，但支撑液膜无法在高萃取电压下保持良好的稳定性，可能导致萃取溶剂流失，需要开发出耐热性强、稳定性好的膜材料。未来样品前处理方法发展趋势将转向绿色高效，主要发展发向可概括为以下几点：①简化步骤，尽可能减少甚至避免使用有机溶剂；
②对目标物质具有较高的选择性，可以在较短时间内完成富集；
③所用到材料易于制备、稳定性强、成本低；
④脱离实验室检测环境，实现商品化，可广泛应用于日常生活的检测。除以上发展趋势外，多种前处理方法联合应用也将是未来分析方法发展的新趋势，优势互补，可以得到更高的富集倍数，更低的检测限。随着食品分析领域的需求不断提高，今后将会不断涌现更多高效、快速、便捷的新型样品前处理技术，为食品中生物胺的快速精准测量提供重要的保障。