陈凤莲，朱青蓝，朱伶俐，陈国飞
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝脏脂肪过度堆积为特征的临床常见的疾病，又被称为代谢相关性脂肪性肝病[1，2]。NAFLD 包括非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、非酒精性脂肪性肝病相关肝硬化和肝细胞癌。NASH为NAFL发展至肝硬化的必经阶段，而NASH未经及时干预治疗，将逐渐进展成为肝纤维化、肝硬化乃至于肝细胞癌。氧化应激、脂质过氧化和线粒体功能障碍是参与NAFLD发病机制的重要因素。此外，机体免疫状态在NAFLD发病过程中也起着重要的作用[3，4]。NAFLD可诱发某些药物引起的肝毒性，而有些药物也会诱发脂肪肝或加重原有的脂肪变性[5]。NAFLD有着复杂的致病机制，例如诱导肝损伤的机制是肝脏氧化应激反应[6]。肝脏免疫反应的调节极其复杂，涉及来自先天和适应性免疫系统的不同类型细胞。恒定自然杀伤T细胞(invariant natural killer T，iNKT)是一种已知会导致肝脏炎症的细胞亚群[7]。目前，iNKT参与人类NAFLD患者病情进展，但其激活机制尚未探明。在毒素代谢、脂毒性、氧化应激过程中合成的代谢产物，或来源于外来抗原和细菌的代谢产物可作为新抗原呈递至人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)分子上，触发T细胞活化以及随后的免疫反应。T细胞的活化伴随着不同细胞表面标记的上调，代表着活化过程中的不同阶段。CD69为T淋巴细胞的最早活化标记物，是一种共刺激分子，能够促进细胞毒性[8]。此外，CD25和HLA-DR则是HLA上晚期活化的细胞表面标记物[9]。自然杀伤组2成员D(NKG2D)也与应激诱导的组织损伤相关，并在肝损伤修复过程中起至关重要的作用[10]。本研究分析了不同NAFLD患者外周血iNKT、CD4+和CD8+T细胞活化标记物CD69、CD25、HLA-DR和NKG2D的表达情况，以更好地阐述它们在NAFLD发病过程中的作用。
1.1 研究对象 2020年1月～2022年7月我院诊治的NAFLD患者64例，男性34例，女性30例；
年龄为(40.6±5.2)岁。NAFLD诊断依据《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》的标准[11]。排除标准：合并恶性肿瘤、酒精性肝病或病毒性肝炎、合并急慢性胃肠道疾病、免疫缺陷病、妊娠期或哺乳期女性。另选择同期健康体检者50例，男性27例，女性23例；
年龄为(39.5±4.9)岁。本研究经我院医学伦理委员会审核通过，纳入对象签署知情同意书。
1.2 外周血iNKT、CD4+和CD8+T细胞检测 采集空腹静脉血4 ml，肝素钠抗凝，使用淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞。使用贝克曼库尔特Gallios流式细胞仪检测iNKT细胞、CD4+和CD8+T细胞亚群早期(CD69+)和晚期活化细胞表面标记(CD25和HLA-DR)以及细胞应激标记(NKG2D)的表达。
1.3 肝组织活检 在GE公司提供的Logic BOOK XP型彩色多普勒超声诊断仪引导下，行经皮肝活检术。嘱受检者采取仰卧位，常规消毒，用5%利多卡因行局部麻醉。使用16 G自动活检枪(BARD 公司)切取肝组织，经固定、石蜡包埋、HE染色。根据临床需要加做免疫组化和特殊染色，如刚果红或PAS染色等。根据肝组织病理学检查结果，将NAFLD分为不同阶段。
2.1 各组外周血CD69+iNKT、CD25+iNKT、HLA-DR+iNKT及NKG2D+iNKT细胞百分比比较 在64例NAFLD患者中，经组织病理学检查发现NAFL 37例和NASH 27例；
健康对照者、NAFL和NASH患者外周血CD69+iNKT细胞百分比分别为(10.1±1.7)%、(6.1±1.3)%和(26.7±3.6)%(P<0.05)；
CD25+iNKT细胞百分比分别为(83.0±5.9)%、(94.1±8.0)%和(90.8±7.5)%(P<0.05)；
HLA-DR+iNKT细胞百分比分别为(15.3±1.7)%、(15.8±2.0)%和(22.3±2.0)%(P>0.05)；
NKG2D+iNKT细胞百分比分别为(44.5±3.5)%、(59.7±4.0)%和(71.3±6.0)%(P<0.05，图1)。
图1 各组外周血细胞百分比比较
2.2 各组外周血CD69+CD4+、CD25+CD4+、HLA-DR+CD4+和NKG2D+CD4+T细胞百分比比较 健康对照者、NAFL和NASH患者外周血CD69+CD4+T细胞百分比分别为(0.7±0.2)%、(0.4±0.1)%和(0.5±0.1)%(P>0.05)；
CD25+CD4+T细胞百分比分别为(1.4±0.6)%、(3.0±1.3)%和(1.5±0.7)%(P>0.05)；
HLA-DR+CD4+T细胞百分比分别为(2.7±0.7)%、(4.1±1.0)%和(3.9±1.0)%(P<0.05)；
NKG2D+CD4+T细胞百分比分别为(1.6±0.5)%、(0.6±0.2)%和(0.9±0.2)%(P<0.05，图2)。
图2 各组CD69+CD4+、CD25+CD4+、HLA-DR+CD4+及NKG2D+CD4+ T细胞百分比变化比较
2.3 各组外周血CD69+CD8+、CD25+CD8+、HLA-DR+CD8+和NKG2D+CD8+T细胞百分比比较 健康对照者、NAFL和NASH患者外周血CD69+CD8+T细胞百分比分别为(2.0±0.4)%、(1.6±0.3)%和(2.1±0.6)%(P>0.05)；
CD25+CD8+T细胞百分比分别为(1.3±0.3)%、(1.1±0.2)%和(1.0±0.2)%(P>0.05)；
HLA-DR+CD8+T细胞百分比分别为(5.0±0.7)%、(6.5±1.0)%和(9.6±1.4)%(P<0.05)；
NKG2D+CD8+T细胞百分比分别为(0.6±0.1)%、(0.5±0.1)%和(0.9±0.2)%(P<0.05，图3)。
图3 各组外周血CD69+CD8+、CD25+CD8+、HLA-DR+CD8+和NKG2D+CD8+ T细胞百分比比较
NAFLD发生机制是复杂的，免疫系统在NAFLD致病过程中发挥着重要的作用，某些药物也可引起肝组织脂肪变性[12]。确定免疫系统在各阶段NAFLD患者发病中的作用至关重要，可以更好地区分这些表型不同的疾病状态。
Maricic I et al报道称iNKT细胞介导的免疫反应参与了小鼠模型从肝脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化的进展过程[13]。我们的研究发现了类似的现象。相较于对照组，NASH患者外周血iNKT细胞百分比显著增高，表明其在NAFLD疾病演变过程中起着重要的作用。在肝组织，iNKT细胞的激活是从脂肪变性向脂肪性肝炎和纤维化发展的关键机制[13]。同时，激活后的iNKT细胞可以表现出强大的促炎效应功能[14]。先前的研究表明，在甲硫氨酸胆碱缺乏喂养的NASH小鼠模型肝组织T细胞表达CD69能力升高[15]。我们发现NASH患者外周血iNKT细胞CD69表达异常升高。以上结果提示CD69+iNKT细胞可以作为区分NAFL与NASH的生物标志物。
高胰岛素血症和胰岛素抵抗与NAFLD代谢组学有关。CD69+iNK T细胞与胰岛素和HOMA-IR之间呈显著正相关，表明该细胞类型在NAFLD发展过程中有着显著的作用[16]。我们也发现NASH患者CD69+iNK T细胞明显增高。在胰岛素抵抗状态下，肝组织发生的主要事件之一是游离脂肪酸的过度积累并进一步转化为毒性代谢产物，可能激活了氧化、炎症、肝纤维化和凋亡信号通路，从而导致NAFL进展为NASH。
NKG2D是应激诱导的组织损伤生物学标志物[10，17，18]。既往研究发现NKG2D在改善肝纤维化进展方面具有一定的作用[19]。我们观察到在NASH患者NKG2D+iNK T细胞显著增高，与有关研究结果类似，因为他们发现NASH患者外周血NK细胞NKG2D表达上调，但单纯性脂肪肝患者NKG2D表达水平与健康对照组相似，由此他们提出假设：NKG2D表达增强是NASH患者肝细胞应激、炎症和肠道微生物群衍生信号的标志[20]。
本研究报道了不同阶段NAFLD患者外周血iNKT细胞、CD4+和CD8+T细胞活化的免疫表型差异，结果发现NASH患者外周血CD69+iNK T细胞百分比增高，提示后者是否可以作为区分不同阶段NAFLD的生物学标志物，值得探讨。
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