陈 平，李前辉，谢 军，孙国壮★
（1.江苏省盱眙县人民医院检验科，江苏 淮安 211700；
2.南京医科大学附属淮安第一医院医学检验科，江苏 淮安 223300）
近年来，由于侵入性诊疗活动的增多，以及抗生素、激素、免疫抑制剂的广泛使用，使得血流感染的发生率不断上升[1]。血培养病原学检测是诊断血流感染的金标准，因此快速检出病原菌对于帮助临床诊断、指导临床合理用药、挽救病人的生命意义重大。现阶段关于血培养病原菌快速检测方法的研究，多是从富集细菌或用幼龄菌做生化鉴定菌种方面入手[2-5]。而通过观察血培养报阳时间（time to positivity，TTP）及报阳菌的生长曲线虽然比生化鉴定菌种方便，但也是多将血培养检出菌按照革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌这样的两大类进行比较分析[6-8]。通过细化在需氧、厌氧两种不同氧气环境下革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌的TTP，能得出在不同氧气环境下不同菌种的血培养TTP 具有差异的结论，进而根据需氧瓶、厌氧瓶的TTP 及血涂片革兰染色形态来辅助鉴别血培养检出菌种类，可以更快速给临床医生提供诊疗依据，且在区分血培养污染菌及致病菌方面同样具有重要意义。本文就血培养TTP 对于血流感染病原菌检测的临床意义进行探讨。
1.1 一般资料
本研究回顾性分析我院2020 年5 月至2021 年12 月送检的血培养阳性标本，其中共涉及男278 例，女246 例；
年龄17 ～99 岁，平均年龄（63.85±11.66）岁。所有患者均签署知情同意书，且本研究经我院伦理委员会批准同意执行。
1.2 纳入及排除标准
纳入标准：（1）严格按照临床检验操作规程，标本为采集血培养标本后立即送检的成人血培养阳性报警标本。（2）同一病人多次送检血培养阳性的，只计首次阳性结果。（3）考虑到不同仪器厂家的设备耗材对TTP 可能产生影响，故本研究仅纳入法国梅里埃公司生产的BacT/AlerT 3D 全自动血培养仪及其配套血培养瓶的培养结果。排除标准：（1）多种菌种引起的菌血症（一瓶血培养瓶中同时分离到的细菌种类≥2种）；
（2）儿童由于其生理特点，血流感染情况相较于成年人特殊，且所用血培养瓶及采血量与成年人相比差别较大，故本研究未纳入儿童患者。
1.3 仪器与方法
1.3.1 仪器 血培养瓶为法国梅里埃公司生产的BacT/AlerT 3D 全自动血培养仪的配套需氧及厌氧血培养瓶，细菌鉴定仪VITEK-2 Compact 及细菌鉴定板卡均采购于法国梅里埃公司。血平板、巧克力平板、麦康凯平板均购自上海科马嘉微生物技术有限公司。
1.3.2 方法 血培养仪报警阳性后，查看细菌生长曲线，记录血培养瓶内细菌的TTP，随后取血进行涂片及革兰染色，镜检观察细菌形态，2h 内发布一级血涂片报告；
根据细菌染色形态，接种相应的支持生长平板，18 ～24h 后根据菌落形态选择合适的鉴定板卡上机进行细菌菌种鉴定及药敏试验，发布最终的血培养鉴定药敏报告。
1.4 统计学处理
运用SPSS 25.0 版统计软件进行数据处理，TTP作为连续型变量按检出菌种分组进行正态性检验，符合正态分布的计量资料用均数± 标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，偏态分布的计量资料以中位数和四分位间距[M（P25～P75）] 表示，组间比较采用秩和（Mann-Whitney U）检验。计数资料用百分比（%）表示，行χ² 检验，P＜0.05 表示有统计学差异。
2.1 成人血培养阳性标本检出菌大体分布情况
血培养需氧瓶及厌氧瓶共检出细菌524 株，其中革兰阴性杆菌检出313 株，占总检出菌的59.73%，革兰阳性球菌共检出211 株，占总检出菌的40.27%。其中革兰阴性杆菌主要包括肠杆菌科（共检出289 株，占总检出菌的55.15%）、常见非发酵革兰阴性杆菌（共检出24 株，占总检出菌的4.58%）等；
革兰阳性球菌主要包括葡萄球菌属（共检出169 株，占总检出菌的32.25%）、链球菌属（共检出31 株，占总检出菌的5.92%）、微球菌属（共检出5 株，占总检出菌的0.95%）、肠球菌属（共检出6 株，占总检出菌的1.15%）等。具体检出菌名称及其分布构成比见表1。
2.2 需氧瓶检出革兰阴性杆菌TTP 中位数（四分位数）的比较分析
在需氧瓶检出的革兰阴性杆菌中，大肠埃希菌的TTP 中位数（四分位数）最小，为10.32（7.68，13.44）h ；
肺炎克雷伯菌肺炎亚种的TTP 中位数与其他肠杆菌科的TTP 中位数（四分位数）居中，分别为11.04（9.24，26.76）h 和11.04（7.20，17.16）h ；
常见非发酵革兰阴性杆菌的TTP 中位数（四分位数）最大，为15.84（12.18，20.58）h。需氧瓶检出的这四类革兰阴性杆菌的TTP 相比，差异有统计学意义（P=0.003）。同时将需氧瓶检出的这四类革兰阴性杆菌的TTP 进行两两比较，得出大肠埃希菌的需氧瓶TTP 与常见非发酵革兰阴性杆菌的需氧瓶TTP 具有显著差异（P＜0.05）。详见表2。
表1 血培养检出菌名称及其分布构成表
表2 需氧瓶检出革兰阴性杆菌TTP 中位数（四分位数）的比较[h，（P25，P75）]
2.3 厌氧瓶检出的革兰阴性杆菌TTP 中位数（四分位数）的比较分析
在厌氧瓶检出的革兰阴性杆菌的TTP 中，大肠埃希菌9.84（7.20，13.20）h ＜其他肠杆菌科10.80（7.44，18.96）h ＜肺炎克雷伯菌肺炎亚种11.00（8.04，15.72）h，厌氧瓶检出的这三类革兰阴性杆菌的TTP相比，差异无统计学意义（P=0.415）。详见表3。
表3 厌氧瓶检出革兰阴性杆菌TTP 中位数（四分位数）的比较[h，（P25，P75）]
2.4 需氧瓶检出革兰阳性球菌的TTP 及事后比较分析
分析需氧瓶检出的革兰阳性球菌的TTP，由于纳入讨论的链球菌属、微球菌属、肠球菌属的菌株数目不多，且TTP 符合正态分布，因此得出其平均TTP 分 别 为（14.60±4.54）h、（48.05±30.57）h、（11.04±2.13）h ；
而凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的TTP 不符合正态分布，因此求其中位数（四分位数）进行分析，二者的TTP 中位数（四分位数）分别为22.44（19.38，28.38）h 和11.76（4.56，16.32）h。采用非参数检验对这五类革兰阳性球菌的需氧瓶TTP 进行比较分析，结果显示差异有统计学意义（P＜0.001）。同时将需氧瓶检出的这五类革兰阳性球菌的TTP 进行两两比较，得出金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌属、金黄色葡萄球菌和微球菌属、链球菌属和微球菌属的TTP 组间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表4。
2.5 厌氧瓶检出革兰阳性球菌的TTP 及事后比较分析
由于纳入讨论的肠球菌属的菌株数目较少，且TTP 符合正态分布，因此得出其平均的TTP 为（11.04±1.87）h；
而金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和链球菌属的TTP 不符合正态分布，因此求其中位数（四分位数）进行分析，其TTP 中位数（四分位数）分别为13.44（9.12，18.36）h、26.16（20.16，37.20）h 和18.48（10.74，25.20）h。采用非参数检验对厌氧瓶检出的这四类革兰阳性球菌的TTP 进行比较分析，结果显示差异有统计学意义（P＜0.001）。同时将厌氧瓶检出的这四类革兰阳性球菌的TTP 进行两两比较，得出金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的TTP 组间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表5。
表4 需氧瓶检出革兰阳性球菌的TTP 及事后比较
表5 厌氧瓶检出革兰阳性球菌的TTP 及事后比较
血流感染可引起菌血症、败血症、脓毒血症，重症患者可发生休克、全身播散性血管内凝血（DIC），甚至在短时间内死亡。传统血流感染的病原学检查，血培养需要的时间较长。虽然近年来随着医疗技术的快速发展，国内各大医院基本上都已经使用了全自动血液培养仪器，但病原菌种类的最终确定仍然需要血培养仪器报警阳性、涂片染色转种、上机鉴定后才能得出最终的鉴定结果。在这种情况下，我们就迫切需要找到一种能够快速预判病原菌种类的方法，来帮助我们做出及时准确的诊断，从而精准合理的用药，以达到有效控制血流感染的目的。TTP 与病人的血流感染严重程度、血培养采血量、采血时机、是否使用抗菌药物以及致病菌的生长繁殖特性密切相关。众所周知，血培养污染菌不加分析就报告给临床，会增加临床病人非必要的医学检查和抗菌药物的使用，延长病人的住院时间并增加医保支出，因此合理分析血培养TTP 及报阳细菌生长曲线，对帮助临床诊断及指导临床合理用药至关重要。
全自动血培养仪进行血培养阳性监测的原理是不同类型的微生物有其不同的生长代谢方式，微生物在培养基中代谢基质或分解糖类时产生CO2。CO2产生越多，培养瓶底部传感器的颜色就会由深变浅，发光二极管反射的光也越强，计算机接受此信息后以加速度、起始值和速率三种方式将产生的CO2量值与培养瓶中初始的CO2水平比较，最终判断是否为阳性，及时发出阳性警报，并显示当时的生长曲线[6]。由于大肠埃希菌是兼性厌氧菌，营养要求低，分解糖产酸产气，CO2生成快，因此血培养的TTP 短；
而非发酵革兰阴性杆菌为专性需氧菌，血培养瓶中的血液代谢也耗氧，抑制其生长，且非发酵革兰阴性杆菌不发酵糖类，氧化分解葡萄糖产酸不产气，产生CO2少且慢，细菌生长曲线迟缓期稳定器均较平坦，为典型的S 型曲线，因此血培养TTP 较长[9]。有研究显示，无氧瓶报警时，TTP ≤18h 可以区分肠杆菌和绝对厌氧菌；
有氧瓶报警时，TTP ≤13h 可以区分肠杆菌科和铜绿假单胞菌等其他革兰阴性杆菌[10]。本文的研究则与这一结论不符，分析原因可能是临床已经使用过抗菌药物致使大肠埃希菌的TTP 延长，以及采血培养后未及时送检的不规范行为致使非发酵革兰阴性杆菌的TTP缩短。另一个原因可能是分析研究的样本量不足导致结果出现偏差。
回顾性分析比较我院524 例成人血培养阳性的TTP，通过比较分析需氧瓶检出的革兰阴性杆菌的TTP，发现大肠埃希菌TTP 的中位数（10.32h）低于常见非发酵革兰阴性杆菌TTP 的中位数（15.84h），差异有统计学意义（P＜0.05）。而肠杆菌科细菌与非发酵革兰阴性杆菌的临床用药存在很大差异，因此这一结论对指导临床用药具有重要的参考意义。通过比较分析需氧瓶和厌氧瓶检出革兰阳性球菌的TTP，得出在需氧瓶报阳时，金黄色葡萄球菌TTP 的中位数为11.76h，凝固酶阴性葡萄球菌属TTP 的中位数为22.44h ；
金黄色葡萄球菌TTP 的中位数（11.76h）与微球菌属的平均TTP（48.05h）、链球菌属的平均TTP（14.60h）与微球菌属的平均TTP（48.05h）差异均有统计学意义（P＜0.05）；
在厌氧瓶报阳时，金黄色葡萄球菌TTP 的中位数为13.44h，显著低于凝固酶阴性葡萄球菌属TTP 的中位数26.16h，差异有统计学意义（P＜0.05）。由于凝固酶阴性葡萄球菌和微球菌属是临床常见的血培养污染菌，而金黄色葡萄球菌和链球菌则为常见的致病菌，并且金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的革兰染色镜下形态无法区分，因此比较血培养革兰阳性球菌的TTP 在区分血流感染致病菌和污染菌上有较高的参考意义[11-13]。相关研究报告，血培养的TTP 与病人的预后也有很大的相关性。血培养的TTP 是影响患者住院病死率的独立危险因素，也是对病死率影响最大的指标[14-15]。观察血培养TTP，发现不管检出菌是革兰阴性杆菌还是革兰阳性球菌，血培养TTP 均有较多的重叠，因为TTP不仅与各种细菌的生长代谢特点有关，还会受到采血量的多少、细菌的浓度、患者是否使用抗菌药物、采血时机等多方面因素的影响。因此在发布血培养一级报告时，除了及时报告给临床革兰染色涂片结果以外，血培养TTP、采血量也是报告中必不可少的关键内容。
综上所述，血培养报阳后，通过观察全自动血培养仪的细菌生长曲线、血液涂片染色形态、报阳时的TTP、检出菌生长的氧气环境及血培养采血量等可以大致判断其所属细菌种类。血流感染时，通过分析血培养TTP、相关的感染炎性指标以及观察病人的相关临床指征，可以进一步确定血培养检出菌是感染菌还是污染菌。及时发布具有TTP 及采血量的信息完善的血培养三级报告，对于改善患者预后、挽救其生命具有重要意义。但本研究只针对成人血培养TTP 进行回顾性比较分析，受纳入样本数量的影响，血培养检出菌种类的分组数量存在一定偏倚，研究具有一定的局限性，因此后期需要更大样本量的支持来进行进一步的研究。
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