■周志刚 杜东东 孟德龙 赵雅洁，3 李道君 栾银银 药园园 杨雅麟
（1.中国农业科学院饲料研究所，中国-挪威鱼类消化道微生物联合实验室，北京 100081；
2.中国农业科学院佛山鲲鹏现代农业研究院，广东佛山 528225；
3.湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州 313000；
4.中国农业科学院饲料研究所，农业农村部饲料生物技术重点实验室，北京 100081）
饲料原料是指来源于动物、植物或微生物等，用于加工制作饲料但不属于饲料添加剂的饲用物质，其中动物源性饲料和植物源性饲料种类繁多[1]（见表1），饲料原料的安全和质量与养殖动物的健康和产量密切相关。动物源性饲料包括陆生动物、水生动物源性饲料，在饲料生产中常作为蛋白质或鱼粉替代原料使用。植物源性饲料包括油料籽实、谷物、块茎根茎、豆科作物以及其他植物类原料，在饲料生产中主要作为蛋白原料和能量原料使用。目前，由于动物源性饲料价格差异较大（进口鱼粉12 000～14 000 元/t；
鸡肉粉9 000～11 000 元/t；
猪肉粉7 000～9 000 元/t），市场上存在较多掺杂掺假现象[2]。例如，将低价的猪肉粉、鸡肉粉、虾壳粉、蟹壳粉等掺入到鱼粉中，将管理上尚未放开的狐狸、貉、水貂成分添加到原料中，这些行为均不同程度影响到饲料原料安全和产品质量[3-4]；
此外，由于不同原料的营养成分和使用效果存在较大差异，掺假掺杂也使得饲料营养价值差异较大，对动物生产带来较大影响。植物源性饲料相对于动物源性饲料价格偏低，掺假掺杂现象相对较少，但是对于不同原料成分进行准确鉴定也是原料质量控制的重要手段，因此，对动物或植物源性饲料的鉴定均十分重要。
表1 动物源性饲料和植物源性饲料（部分）[1]
为了应对动物源性饲料中掺假掺杂现象以及对植物源性饲料种类鉴定，各类检测方法被不断开发出来，包括感官检测[5]、显微镜检测[6]及氨基酸含量检测[7]等，这些检测方式简便、易处理，只是需要配备经验丰富的技术人员进行辨别，且只能根据典型的形态特征对原料成分做出主观判断，无法准确鉴定到具体种类。与上述检测方式相比，通过分子生物学手段以饲料原料成分中的蛋白质和核酸为对象则能检测出具体的种类。由于饲料原料在高温高压、酸碱条件的加工方式下可能使蛋白质变性存在不稳定性，而DNA作为遗传物质，是由脱氧核糖核酸组成的生物大分子化合物，广泛存在于几乎所有组织、细胞中，具有高度的稳定性，在实际检测中以DNA 为基础的检测方法更加实用和稳定，即称之为基因检测。基因检测方法具有特异性高和灵敏度高的特点，被广泛应用于深度加工产品的检测，使用该方法检测饲料原料，在实际产业中具有相对优势和参考意义。
目前，通过基因检测的方式对动植物源性饲料原料进行检测的研究已有大量的报道[8-10]，但是由于饲料原料需要经过复杂的加工过程且种类丰富，面向更广泛饲料原料的检测方法和检测体系还不够完善，文章对饲料原料基因检测原理、检测方法及原料检测中的应用等方面进行归纳总结，并展望了未来的发展趋势，对于饲料原料溯源、防止饲料原料掺假掺杂具有产业价值。
基因检测是以遗传物质DNA 为基础，通过不同的方式对DNA中保守序列的特异性片段进行鉴定以确定物种类别。基因检测中靶基因的选择至关重要，直接关系着检测的准确性和灵敏度，通常选用物种特异性序列作为鉴定靶标。物种序列特异性具有种间特异性和种内保守性两层含义，种间特异性可以对不同物种进行鉴定，而种内保守性可以对同一物种不同品系的检测时具有较好的一致性[11]。
动物源饲料原料的鉴定以线粒体DNA和核基因作为靶基因，线粒体DNA 具有种间变异性高、丰度高、无内含子和等位基因等特点[12]，使物种鉴定的特异性强、灵敏度高，在基因检测应用多于核基因。Rastogi 等[13]通过对线粒体的16S rDNA和ND4基因与核基因的肌动蛋白基因进行评估，发现线粒体标记在物种鉴定方面比核标记更有效。线粒体靶标基因主要有12S rRNA、16S rRNA、细胞色素C 氧化酶I（COI）基因、线粒体细胞色素氧化酶B（CYTB）基因、置换环区域（D-loop）、NADH 脱氢酶2（ND2）基因、NADH 脱氢酶5（ND5）基因和三磷酸腺苷酶（ATPase6/ATPase8）基因等。Girish等[14]根据12S rRNA基因对牛、水牛、绵羊、山羊和大额牛进行鉴定，Haunshi等[15]利用D-loop区域、CYTB基因成功对鸡、鸭、猪、鸽子进行鉴定，笔者实验室利用16S rRNA、COI、CYTB等线粒体基因对猪、牛、羊、鸡、鸭、狐、貉、南美白对虾、小龙虾、蟹、南极磷虾、兔、扇贝、牡蛎、乌贼、鱿鱼、巴沙鱼、罗非鱼、鮰鱼、沙丁鱼、鳀鱼、鳕鱼、鲽鱼23种动物的鉴定有较好的效果（数据未发表）。使用高拷贝的线粒体基因作为检测靶标，可以降低检测限，在定性检测中具有较好的优势，但由于线粒体基因的高拷贝数，可能会影响定量PCR 中的线性关系，导致定量检测的不准确，而且线粒体基因在不同组织中拷贝数不同，也是影响基因定量检测的重要因素，因此基因定量检测中常常选用核基因中的单拷贝基因作为鉴定靶标[16]。核基因的靶标主要包括β-肌动蛋白（β-actin）基因、短散在原件（SINE）、长散在原件（LINE）、转化生长因子β（TGFβ）基因、朊蛋白（PRNP）基因、生长激素（GH）基因等。Xiang 等[17]以Actb为靶标建立了鸡的基因检测方法，检测限为10 pg/DNA；
刘立兵等[18-19]以TGFβ-3、PRNP、GH基因为靶基因，建立肉制品中鸡、猪、牛、鸭源性成分的定量检测方法，并检测出市场上标注为猪肉肠的商品中含有18.68%鸡源性成分，88 份肉制品中检测出11 份含有鸭源性成分，含量为18.6%～87.4%。
在植物源检测中（见表2）常用的基因包括核糖体基因ITS以及位于叶绿体上的靶基因核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（rbcL）、成熟酶K（matK）基因、trnLH、trnH、psbK和psbA等。郭丽嵘等[20]利用ITS2序列作为DNA 条形码可以方便、快速地鉴别鬼箭羽及其混伪品；
张彦斌等[21]对豆乳饮料中的外源基因CaMV35S和NOS基因进行微滴数字PCR以检测转基成分，检测含量的最低限为0.05%；
韩建勋等[22]以甘油-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）、ITS1-5.8S-ITS2、rbcL、查尔酮异构酶（CHI）等基因设计红薯、藕、山药以及葛根特异性引物探针对50 份市售淀粉样品进行检测，标签错误标识率达32%。笔者实验室根据ITS、matK、rbcL、trnH-psba、trnL等基因鉴定了油菜籽、大豆、花生、葵花籽、棉籽、油棕榈、芝麻、花椒、辣椒、稻谷（大米）、高粱、大麦、小麦、玉米、燕麦、马铃薯、木薯、苹果18 种植物，有较好的效果（数据未发表）。
表2 动植物源基因检测常用靶基因
在DNA 分子水平上以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术已逐步成为动物源成分鉴定的核心方法，主要包括常规PCR 法、多重PCR 法、荧光定量PCR（qPCR）、微滴数字PCR（ddPCR）、随机扩增多态性DNA分析（PCR-RAPD）、限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）、DNA条形码（DNA barcode）等（见表3）。
表3 基因检测技术方法
常规PCR 是最简单的一种PCR 形式，实现DNA体外大量扩增。常规PCR 结合琼脂糖凝胶进行电泳能够使PCR扩增产物可视化，从而对检测对象的有无进行定性的判断[30]。目前，常规PCR方法已经在物种鉴定、病原检测等方面广泛应用。常规PCR能够对检测样品成分进行鉴定，但是一个反应体系只能检测一个物种，当检测种类较多时就存在大量重复性操作，人力物力耗费多。多重PCR 技术是指在一个PCR 体系里同时加入多种引物，来达到同时对多个物种的鉴定[31]。与普通PCR 相比，检测效率更高、更加省时。实时荧光定量PCR，是指在普通PCR 的基础上，检测每次循环中荧光信号的含量，以此达到定量的目的[32]，基本原理是样本核酸扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物（荧光探针）与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量[33]。与常规PCR 和多重PCR相比，荧光定量PCR 不仅可以对检测样品定性，还能进行准确定量。微滴数字PCR 技术是近年来发展起来的定量分析技术，通过将PCR 体系分配到以油包水微滴的形式实现对核酸的稀释，在约2 万个独立的反应液滴中进行独立PCR 反应，经过定量分析获得结果[34]。
随机扩增DNA 多态性分析（PCR-RAPD）是使用多对引物在基因组DNA 中进行随机PCR 扩增后，经琼脂糖凝胶电泳检测，每个样本都可获得多条扩增条带，从而获得具备物种特异性的DNA 图谱。该技术使用的引物长度在10 bp 左右，被广泛应用于物种的聚类分析[30]。此方法在不知道基因组序列的情况下，依旧可以通过PCR扩增达到区分的目的，并且具备方法简单、重复度高的特点[35]。
DNA条形码是生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短DNA 片段[36]。DNA条形码是基于条形码间隙的原理，条形码间隙是指种内和种间平均遗传距离之间的差异。条码间隙越大，就越能实现可靠的物种判别[37]。
3.1 常规动物源性饲料基因检测
基因检测在常规动物源性饲料鉴定中已经有大量的报道，徐艳芳等[38]利用常规PCR 方法实现了对动物源性饲料中羊组织成分的检测，检测的灵敏度可达20.16 pg/μL，花费时间约3 h；
Nesvadbova 等[39]通过多重荧光PCR 对原料中最为常见的猪源、鸡源、牛源成分成功建立了检测方法；
庞杰等[40]通过设计青鱼、草鱼、白鲢、鲫鱼等多种鱼类通用的鱼类特异性引物，利用荧光定量PCR方法对饲料中鱼源成分进行检测，最低检测限为0.05%。除饲料原料中较为常见的动物源种类外，陈颖等[41]通过对特异性片段设计引物并结合酶切的方式对马属（马和驴）成分进行鉴定，并应用于肉骨粉的检测，结果显示鉴定的样品中不含马或驴的成分；
刘艳艳等[3]通过设计特异性引物和探针建立了狐狸、水貂、貉和狗的多重荧光定量PCR 检测方法，特异性好，灵敏度高，并对市售的40 份不同来源的肉粉进行检测，其中5 份含有狐狸、水貂、貉成分；
Dudu 等[42]通过限制性片段长度多态性分析方式实现对不同种类的鲟鱼和鲑鱼进行检测。在动物源饲料的检测中，已颁布相关的国家标准、地方标准和行业标准，主要是基于常规定性PCR 法、限制性片段长度多态性分析和实时荧光PCR 法对猪、鸭、牛、羊、鹿、马、驴、狗、兔、骆驼等单一动物源性成分的定性检测[43-53]。
通过归纳以上的报道发现，在饲料原料的基因检测中动物源检测的报道比较多，但是大多是以某几个物种检测为主，而饲料原料种类多样，依然存在动物源性饲料检测覆盖度不够的问题。因此笔者实验室针对目前常见的饲料原料种类，结合饲料实际生产过程，归纳出23 种常见的动物源饲料种类（猪、牛、羊、鸡、鸭、狐、貉、南美白对虾、小龙虾、蟹、南极磷虾、兔、扇贝、牡蛎、乌贼、鱿鱼、巴沙鱼、罗非鱼、鮰鱼、沙丁鱼、鳀鱼、鳕鱼、鲽鱼），以线粒体上保守序列的特异性片段为靶标，成功设计出物种特异性引物，通过验证能够准确区分这23 种动物源，且灵敏度达到1%，能够满足实际检测需求，极大地扩展了动物源性饲料基因检测范围，这是目前为止最全面的动物源性饲料种类检测。此外，以这23 对引物为基础，建立了以常规PCR 作为检测方法的饲料原料基因检测体系，并利用设计的引物对市场上的鱼粉、肉粉进行检测，发现肉粉主要是猪肉粉和禽肉粉（鸡源和鸭源），常见鸡肉粉掺猪源成分，猪肉粉掺羊源、牛源成分，少数掺狐、貉成分；
鱼粉，主要是沙丁鱼粉和鳀鱼粉，常见掺巴沙鱼和罗非鱼，个别掺虾源、鸡源和猪源成分。
在动物源性饲料基因检测中，传统PCR 和多重PCR因操作简单、技术成熟、成本相对较低、实用性强等特点，是较为常用的检测手段。限制性片段长度多态性分析在常规PCR 基础上进行酶切获得不同长度的片段可以作为判断的依据，增加了检测的准确性，也是常见方法。但是这几种方法均不能进行定量检测，荧光定量PCR虽然成本较高，需要特定的仪器，但是可以弥补不能定量检测的不足，研究也比较常见。其他的基因检测方式在饲料中应用较少，但在食品和肉类中已经有相关的报道，可以作为动物源性饲料基因检测的参考。Temisak等[26]以单拷贝的β-actin核基因为靶标，同时选择肌肉生长抑制素基因作为鉴定基因，成功地以ddPCR方法对牛肉中的猪肉成分进行定量检测，定量检测线为0.1%（w/w），鉴定检测线为0.01%；
Quinto等[54]利用DNA条形码鉴别技术，成功分析46种纯肉类和混合肉类物种，包括一些近缘物种，如野牛与牛肉。以上报道表明，基因检测技术在动物源性饲料检测中的应用十分广泛（见表4）。
表4 动物源基因检测
3.2 昆虫类动物源性饲料基因检测
随着饲料蛋白质需求的不断增加，昆虫由于其50%以上的高蛋白含量、繁殖快等优点逐渐被关注，主要包括黄粉虫、黑水虻、蚕蛹等[10，76]。由于昆虫源性饲料是在近几年作为饲料原料使用，目前还未见到基因检测技术用于昆虫源性饲料中检测的相关报道。因此，笔者实验室针对三种常见的昆虫（黄粉虫、黑水虻、蚕蛹），根据其线粒体特异靶序列，设计了特异性引物，用于昆虫源性饲料基因检测。为了更适用于饲料多样性的特点，这些引物不仅用于这三种昆虫之间区分鉴定，还可用于与上述23 种常规动物源区分鉴定。昆虫作为饲料使用具有较大的潜力，对其种类鉴定方法进行研究也具有重要意义，建立多种特异性好、灵敏度高、实用性强的昆虫源饲料的基因检测方法是今后饲料鉴定发展的重要方向。
3.3 植物源性饲料基因检测
和动物源饲料价格高、容易掺假相比，植物源饲料更倾向于成分的鉴定，目前利用基因检测鉴定植物源性饲料组分的研究较少。鉴于基因检测在食品以及药材成分鉴定的广泛应用可以作为植物源性饲料检测鉴定的参考（见表5）。粟智平等[28]对绿豆、豌豆、玉米、红薯和马铃薯进行引物设计，得到5 对特异性强的引物，分别是MP4、PEP2、CP1、SP2 及POP2，PCR的检测灵敏度可达5%。Kim 等[81]根据ITS2序列对青花椒进行特异性引物设计，采用常规PCR对目的序列进行扩增，并且通过序列比对证明ITS2序列的物种特异性优于matK和rbcL两个序列。Bai 等[77]利用qPCR技术从苦苣、荠菜、红花桤木、紫檀、三角栌、紫花苜蓿和紫花堇菜等草本植物中以0.001 ng/μL的高灵敏度准确鉴定出夹竹桃。韩晴等[87]设计引物ITS2-2和trn H-psb A-1用作鉴别杏仁露中花生源性成分的植物DNA 条形码组合，检测限为6.94%。陈佳等[78]通过设计欧洲甜樱桃和苹果的特异性引物，建立了ddPCR的检测方法，掺假模型中最大的相差误差为-19.17%，可快速进行成分鉴定。
表5 植物源基因检测
针对植物源性饲料鉴定，笔者实验室为了建立植物源饲料鉴定体系，根据植物线粒体以及叶绿体的保守序列，对目前常见18 种植物源原料设计特异性引物，可以在短时间内区分出不同种类。以这18 对引物为基础，建立了种类覆盖比较全面的PCR鉴定植物源性饲料的鉴定体系。
3.4 检测案例
以笔者实验室设计的动植物源特异性引物检测饲料原料样品结果为示例。
3.4.1 肉粉
检测了4 种不同来源的肉粉（3 种鸡肉粉，1 种未知类型肉粉），检测结果如图1所示。经检测，鸡肉粉1 中只含有鸡源成分，未检出其他组分，未发现掺假（图1a）；
鸡肉粉2 中除检测出鸡源成分外，还检测出猪源成分，为掺假样品（图1b）；
鸡肉粉3 中除检测出鸡源、鸭源成分外，还检测出猪源成分，为掺假样品（图1c）;未知样品检测出含有猪源、鸡源成分，可能是掺假的鸡肉粉或猪肉粉，且该样品中还检测出尚未开放添加的狐源成分（图1d）。
图1 肉粉检测示例（a～c分别为鸡肉粉1～3；
d为未知成分肉粉）
3.4.2 鱼粉检测
检测了2种不同来源的鱼粉，结果如图2所示，鱼粉1为沙丁鱼或鳀鱼粉，未检出其他成分（图2a）。鱼粉2 为沙丁鱼或鳀鱼粉，掺有牛源、鸡源、巴沙鱼、罗非鱼成分，为多种成分掺假鱼粉（图2b）。
图2 鱼粉检测示例（a～b 分别代表鱼粉1、鱼粉2）
3.4.3 昆虫源饲料
检测了黑水虻原料，结果如图3 所示，黑水虻虫干样品中只检测出黑水虻成分，未检测出其他成分。
图3 黑水虻原料检测示例
3.4.4 植物源原料
检测了2种植物源原料（玉米蛋白粉和大豆酶解蛋白），结果如图4 所示。玉米蛋白粉经检测除含有玉米成分外，还检测大豆成分，为掺假样品（图4a）；
大豆酶解蛋白样品中只检测出大豆成分，未检测出其他成分（图4b）。
图4 植物源原料检测示例（a为玉米蛋白粉；
b为大豆酶解蛋白）
随着畜禽水产等养殖规模的不断扩大，饲料产业也达到一个新的高度。然而，饲料原料中掺假现象十分严重，使得饲料营养成分大打折扣，影响了动物的生产性能，甚至严重影响了经济效益。因此，饲料原料的检测鉴定手段创新对于饲料产业的发展具有广泛的意义。基于基因检测区分物种的方式越来越多，在本文中已经进行了列举，同时也展现出其在饲料原料检测领域中的应用潜力，但是基因检测体系在饲料原料中的应用还并不成熟。
①检测范围不够广泛。饲料原料种类丰富，尽管目前已经建立了针对常见动植物源中的检测方法，但是随着饲料原料种类的扩大，仍需要增加物种检测种类，扩大检测范围。
②检测体系需要完善，提高检测效率，降低检测成本。基因检测过程主要包括DNA 提取、PCR 扩增及结果分析，前两个过程可与自动化设备相结合，大幅度提高检测的效率，较好地解决检测中工作量繁琐的问题，还可以缩短检测时间，减小工作量，降低检测成本。另外，饲料原料属于深加工产品，且成分中可能存在虾壳、蟹壳、羽毛和高油脂组织等DNA含量低提取困难的成分，会影响基因检测准确性，因此DNA提取过程进行优化和摸索，对提高检测的准确性也十分重要。
③检测方式简化。基因检测需要较多的检测步骤，一般需在实验室内经技术人员完成。结合原料实际生产及采购需求，简易式现场检测技术成了未来的发展方向。胶体金技术是通过结合抗原抗体特异性反应对样品进行检测，新型冠状病毒、黄曲霉素等胶体金免疫层析试纸条检测被广泛使用，不受仪器设备限制，成为下一步开发方向。
猜你喜欢饲料原料源性特异性后溪穴治疗脊柱源性疼痛的研究进展中国中医急症(2019年10期)2019-05-21精确制导 特异性溶栓中国医疗保险(2017年5期)2017-05-17BOPIM-dma作为BSA Site Ⅰ特异性探针的研究及其应用三峡大学学报(自然科学版)(2016年6期)2016-04-16重复周围磁刺激治疗慢性非特异性下腰痛的临床效果中国康复理论与实践(2015年10期)2015-12-24雄激素源性秃发家系调查川北医学院学报(2015年5期)2015-12-05儿童非特异性ST-T改变现代电生理学杂志(2015年1期)2015-07-18健康教育对治疗空气源性接触性皮炎的干预作用中国医疗美容(2015年1期)2015-07-12椒莲酊剂治疗男子雄性激素源性秃发50例中医研究(2014年8期)2014-03-11常用谷物饲料原料营养成分养殖与饲料(2014年10期)2014-02-28广东饲料原料报价养禽与禽病防治(2012年3期)2012-08-01