谢湘云， 陈春丽， 张 亮， 常占瑛， 王 梅,3， 唐 城， 高晓黎,3
(1新疆医科大学药学院， 2新疆及中亚特色医药资源教育部工程研究中心， 3新疆天然药物活性组分与释药技术重点实验室，乌鲁木齐 830017；
4新疆特丰药业股份有限公司，乌鲁木齐 830000)
固体药物物态可以分为晶型与无定型，研究表明晶型原料药会受温度、湿度、压力、溶剂、工艺等条件影响而发生晶型转化，不同的晶型可能会影响制剂的稳定性、质量及疗效[1]。制剂质量问题的调整和解决应该首先分析原料药的性质，其次是辅料包材的相容性，再次考虑制剂的处方工艺。在制剂研发前，缺乏科学完善的原料药研究，随意从市面上选用一种进行制剂的研发工作，会使得制剂的质量和安全性很难得到有效的控制[2]。复方甘草酸苷片是由甘草酸单铵盐(Monoammonium Glycyrrhizinate，MAG)、甘氨酸(Glycine，Gly.)、DL-甲硫氨酸(DL-Methionine，Met.)组成的复方制剂，各类成分相互配伍，可用于慢性肝病、肝功能异常、湿疹、皮肤炎、斑秃等的治疗[3-6]。甘草酸苷具有抑制或杀灭病毒、消炎、免疫调节等多种药理作用[7-8]。Gly.和Met.可缓解甘草酸苷的副作用，提高肝脏解毒能力，减少过敏反应。目前对甘草酸类制剂的研究多集中在药效药理方面，对该制剂原料药晶型及其晶型转化的研究鲜有报道。研究表明Gly.和Met.均具有多晶现象，主要有α、β、γ-型等[9-13]，它们具有不同的晶癖、空间群对称性及稳定性，更好地了解这两种氨基酸原料药的固态理化性质、晶型稳定性及转化条件，对确定合适的药用优势晶型、储藏条件、改进制剂工艺等方面都有重要的意义。本研究采用X-射线粉末衍射(X-ray powder diffraction，XRPD)、扫描电镜(Scanning electron microscopy，SEM)、同步热分析(Simultaneous thermal analytical techniques，TGA/DTG-DSC)、傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)等多种手段对复方甘草酸苷片中的Gly.和Met.两种氨基酸原料药进行固体理化性质和晶型稳定性的考察，为制剂研发原料药优势晶型的选择、稳定性研究及质量控制提供数据支持。
1.1 仪器STA449 F3型同步热分析仪(德国耐驰)；
IR-Prestige-21型傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津)；
JSM-7610FPLUS型扫描电子显微镜(日本电子)；
D8型X-射线衍射仪(德国布鲁克)；
TYM-8型超微粉碎仪(中国济南天宇专用设备有限公司)；
HELOS/RODOS型激光粒度仪(新帕泰克公司)；
DKZ-1型电热恒温振荡水槽(上海精宏实验设备有限公司)；
DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；
DF3-2型红外线干燥箱(北京兴争仪器设备厂)；
HPP750型稳定性测试箱(德国美墨尔特有限公司)。
1.2 试药甘氨酸(天津天药药业有限公司，AGLYB190114/AGLYB190442)；
DL-甲硫氨酸(修正药业集团柳河制药有限公司，20181112/20190814/20190919)；
溴化钾(上海阿拉丁试剂有限公司，C1911010)。
2.1 Gly.和Met.原料药的固态理化性质表征
2.1.1 X-射线粉末衍射(XRPD)分析 分别取Gly.和Met.原料药，过100目药典筛。采用CuKα靶，以步长0.01°/s的速度扫描，管电压/管电流：40 kV/40 mA，衍射角范围为5°～80°，分别对两种原料药进行XRPD分析。
2.1.2 扫描电镜(SEM)分析 分别取少量Gly.和Met.原料药喷金处理后，采用JSM-7610F plus扫描电子显微镜，在低真空模式下，以加速电压5 KV，放大不同倍数分别对Gly.和Met.原料药表面状态进行观察。
2.1.3 粒径分布 分别取1.0 g Gly.和Met.原料药粉末，采用干法测试，光学浓度5%～10%，分散压力1 bar，进样速率40%，抬升高度1.5 mm，每个样品进行3次独立的检测，数据处理采用Fraunhofer理论的FREE模式。
2.1.4 同步热分析(TGA/DTG-DSC) 分别取Gly.和Met.原料药，采用Al2O3坩埚，升温区间：室温～900℃，N2气，流速50 mL/min，升温速率为10℃/min。
2.1.5 傅里叶红外光谱(FTIR)分析 分别称取Gly.和Met.原料药2 mg，加入烘干(105℃，烘干6 h以上)后的KBr 200 mg，在玛瑙研钵内研细，采用KBr压片，在4 000～500 cm-1的范围内采集，分辨率为2 cm-1，扫描20次，测样前，均进行KBr空白背景扫描。
2.2 Gly.和Met.晶型稳定性考察
2.2.1 高温试验 分别将Gly.和Met.原料药置于敞口洁净称量瓶中(厚度不超过3 mm)，60℃真空干燥箱内放置10 d，于第10 d取样，按“2.1.1”项下条件进行XRPD分析。
2.2.2 高湿试验 分别将Gly.和Met.原料药置于敞口洁净称量瓶中(厚度不超过3 mm)，稳定性测试箱(25℃，相对湿度 75%±5%)内放置10 d，于第10 d取样，按“2.1.1”项下条件进行XRPD分析。
2.2.3 溶剂的影响 分别将Gly.和Met.原料药约1 g置于洁净的锥形瓶中，加入20 mL去离子水，于60℃下75 r/min的恒温振荡水槽中振荡4 h，过滤，室温放置，析晶，将获得的原料药按“2.1.1”项下条件进行XRPD分析。
2.2.4 粉碎后对晶型的影响 用粉碎机在温度<10℃条件下，分别对Gly.和Met.原料药进行粉碎处理，获得的粉末分别过325目筛，按“2.1.1”项下条件进行XRPD分析。
3.1 Gly.和Met.原料药的固态理化性质分析
3.1.1 XRPD结果分析 2个批次Gly.和3个批次Met.的XRPD图谱如图1所示，特征衍射峰值(2θ)及强度(I/I0)如表1所示。由图1A可知，Gly.特征衍射峰位2θ在14.8°、19.0°、23.9°、28.4°、29.2°、29.9°、35.4°各值的±0.2°范围内与α-型Gly.峰位一致[8]。Met.的特征衍射峰位2θ在5.6°、21.7°、22.3°、32.8°、33.8°各值的±0.2°范围内与α-及γ-晶型主要的衍射峰一致，其中21.7°和32.8°的±0.2°范围内的衍射峰为α-型特征峰，22.3°和33.7°的±0.2°范围内的衍射峰为γ-型特征峰，故所考察Met.为ɑ-和γ-型混晶。由图1B可知，3个批次的Met.主要在2、3、4和5(如图1B所示)4个衍射峰强度有差异，各批次所含的ɑ-和γ-型比例有差异。
3.1.2 SEM结果分析 对Gly.和Met.固体粉末进行SEM扫描的结果如图2所示。由结果可知，放大200倍后，甘氨酸为不规则块状，表面光滑；
DL-甲硫氨酸为团聚的片状，表面明显吸附了很多微小颗粒，说明DL-甲硫氨酸具有一定吸附作用。
表1 Gly.和Met.的特征衍射峰位(2θ)及强度(I/I0)结果
图1 Gly.(A)和Met.(B)的XRPD图谱
图2 Gly.(A)和Met.(B)的SEM图(×200)
3.1.3 粒径分布结果分析 Gly.和Met.的颗粒粒径结果和累积频度分布曲线见表2及图3所示。通过干法测试确定Gly.和Met.原料药粉碎80目的d10：10 μm以下；
d50：60～90 μm；
d90：170～240 μm。表面积平均粒径(SMD)分别为17.22±0.22 μm和21.72±0.50 μm，体积平均粒径(VMD)分别为71.30±0.32 μm和104.52±1.24 μm。
3.1.4 TGA/DTG-DSC结果分析 Gly.和Met.的同步热分析结果和TGA/DTG-DSC曲线见表3及图4所示，Gly.和Met.在230℃之前未出现任何吸热峰和失重平台，说明原料药不含有溶剂或水分。由DSC曲线可知，Gly.(Tonset=232.4℃，Tpeak=257.4℃，ΔHf=773.5 J/g)出现了一个吸热峰，该吸热峰为Gly.的分解峰，且吸热峰较强较尖锐，说明本品纯度很高。由TGA-DTG曲线(图4A)可知，DTG曲线出现一个峰(Tonset=240℃，Tpeak=258.6℃)对应TGA曲线的失重平台，失重率79.5%。Met.的热学行为与Gly.类似，由于Met存在混晶情况，本研究对两个批次的Met.(20181112，20190814)进行了热行为考察，由图4B可知，两个批次的DTG曲线均只有一个尖锐峰，对应TGA曲线的失重平台，失重率约98%，两个批次的DSC曲线的Tpeak(284.0℃ vs 284.9℃)和ΔHf(769.8 J/g vs 783.3 J/g)存在差异，结合XRPD分析可知，含α-型Met.越多，其Tpeak向高温移动，ΔHf也增加。
表2 干法测试Gly. 和Met.的颗粒粒径结果(n=3)
图3 Gly.(A)和Met.(B)干法测试累积频度分布曲线(n=3)
表3 Gly.和Met.的热分析结果
注：黑色为DSC曲线，蓝色为TGA曲线，橙色为DTG曲线。
3.1.5 FTIR结果分析 Gly.和Met.的FTIR如图5所示，红外特征衍射峰均与标准图谱一致，其中图5A中的911 cm-1处特征峰是α-型Gly.的特征峰(γ-型为930 cm-1)[11]，说明所测定的甘氨酸为α-型，进一步证实了XRPD的结论；
图5B为Met.特征红外光谱图，各特征峰与Met.标准图谱一致，各批次特征峰位与强度基本一致，无法用FTIR分析出Met.不同晶型的差异。
3.2 晶型稳定性考察结果
3.2.1 Gly.的晶型稳定性分析 Gly.在室温条件、高温(60℃)与高湿(25℃，相对湿度 75%±5%)条件下放置10 d、60℃水中分散结晶、粉碎后的XRPD衍射图如图6所示，各条件下衍射峰位(2θ)一致，说明α-型Gly.在上述条件下晶型稳定，未发生转晶现象。
图5 Gly.(A)和Met.(B)的FTIR光谱图
注：1, 室温；
2, 高温(60℃)放置10 d；
3, 高湿(25℃，相对湿度75%±5%)放置10 d；
4, 60℃水分散后结晶；
5, 粉碎。
3.2.2 Met.的晶型稳定性分析 Met.在室温条件、高温(60℃)与高湿(25℃，相对湿度75%±5%)条件下放置10 d、60℃水中分散后结晶、粉碎后的XRPD衍射线如图7所示，在高湿(25℃，相对湿度75%±5%)条件下放置10 d后，各衍射峰位2θ与0 d一致，未发生晶型转化；
在高温(60℃)条件下放置10 d，Met.在(21.7±0.2) °和(32.8±0.2)°处的两个衍射峰消失，γ-型全部转为ɑ-型；
在60℃水中重新分散结晶或粉碎(<10℃)后，(22.3±0.2)°和(33.7±0.2)°的两个衍射峰消失，ɑ-型转为γ-型，说明Met.在高温下(>60℃)以ɑ-型稳定，在低温条件或重结晶后以γ-型稳定存在。
注：1, 室温；
2, 高温(60℃)放置10 d；
3, 高湿(25℃，相对湿度 75%±5%)放置10 d；
4, 60℃水分散后结晶；
5, 粉碎。
本研究发现在水溶液中ɑ-型甘氨酸能自发成核和生长。固体ɑ-型甘氨酸在室温、高温(60℃)与高湿(25℃，相对湿度 75%±5%)条件下放置10 d或粉碎处理后，其晶型均未发生转变。有研究表明，γ-型晶体虽然在非线性光学材料领域有巨大的应有潜力，但γ-型晶体是不容易制得，其成核和生长受到温度、溶剂及添加剂等条件的影响[13-15]，在温度约170℃或高温高湿条件下，γ-型会转化为ɑ-型，会导致甘氨酸结块[16]。本研究结果表明ɑ-型甘氨酸原料药在工艺处理及短期贮存过程中稳定，不易发生转晶行为，可作为药用优势晶型原料药。
本研究发现Met.存在固态转晶和溶液介导的转晶行为。对于溶液介导的转晶，即使Met.处于高温(60℃)水溶液中，重结晶后也只有γ-型晶体而没有α-型晶体，这可能是由于α-型Met.在水中的溶解度高于γ-型[17]，γ-型Met.比α-型更易达到过饱和，γ-型晶体易发生成核和生长，说明溶液介导的转晶可能取决于晶体的性质而不是所处的环境条件，即使处于高温条件，也不会生成α-型晶体。Met.的溶解度依赖于pH，溶解度在等电点时最小，不同晶型溶解度的不同也会导致成核和生长速率的变化而导致形态和团聚情况的不同，需进一步对Met.的溶液介导的转晶行为及机制作进一步的研究。对于Met.的固态转晶，固体γ-型Met.在高温60 ℃下会迅速转变为α-型晶体，低温下γ-型Met.更稳定[18]。固体Met.的晶型转变仅由热引起，即使从溶液中很容易得到γ-型晶体，固体γ-型晶体在高温下也会迅速地转变为α-型，无论晶体存在的环境如何，固态晶型转变都可能发生，极易出现混晶情况。
在仿制制剂研发过程中，XRPD分析是一种快速、简单、灵敏的鉴别氨基酸不同晶型的有效手段。FTIR法也可用于甘氨酸不同晶型的鉴别，910 cm-1处为α-型特征峰，930 cm-1处为γ-型特征峰，对于Met.原料药，该法就不能很好的鉴别出不同晶型的差异。采用激光粒度仪的干法测试系统对两个氨基酸的粒度分布进行检测，由于原料药均为白色粉末状药物材料，可以选择通用光学参数即折射率1.523，密度默认为1来进行，研究结果表明光学浓度控制在5%～10%之间，可以得到高稳定性和重复性的结果，避免了采用湿法测试样品在分散介质中部分溶解而改变样品本身粒径的风险。因此在后续制剂研发和生产过程中，可以利用XRPD和激光粒度仪的干法测试来有效地掌握原料药的晶型和粒度分布情况。
综上所述，通过对两种氨基酸固态理化性质及晶型稳定性的考察，可为后续制剂研发原料药优势晶型的选择与控制、储藏条件、制剂工艺改进等提供实验基础，本研究采用的原料药虽然达到了国家规定的化学标准，由于固态转晶和溶液介导转晶的存在，会导致原料药物态状态存在差异，这种差异是否会对最终制剂质量产生影响有待于进一步研究。
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