滕哈燕，张振忠，汝少国，王 军
(中国海洋大学海洋生命学院, 山东 青岛 266003)
卵黄原蛋白(Vitellogenin, Vtg)是一种雌激素特异性蛋白，通常只存在于卵黄生成期的雌鱼体内，雄鱼或幼鱼只有在外源雌激素的刺激下才能产生该蛋白[1]。鉴于该特性，Vtg被广泛用作检测环境雌激素污染的生物标志物。通过测定雄鱼或幼鱼体内Vtg的含量可以有效地指示水环境的雌激素污染状况[2]。如Sun等[3]以日本虾虎鱼(Acanthogobiusflavimanus)体内的Vtg含量评价了日本沿岸海水的雌激素污染水平；
Zhang等[4]利用褐牙鲆Vtg指标评价了乙炔雌二醇的雌激素活性。目前，Vtg的检测多采用Western blot、ELISA与电化学传感器等免疫学方法[5-6]。这些方法虽然具有灵敏、准确等优点，但是操作复杂、耗时较长、需要特殊的设备与试剂，并且只能在实验室内开展，满足不了现场检测的需求。为快速评估海洋环境雌激素的污染状况，有必要开发一种适用于野外鱼类的Vtg快速检测技术。
免疫胶体金试纸条是目前最常用的即时检测工具。该试纸条以条状纤维材料为固相载体，借助毛细管的吸附作用，使样品在层析材料上移动，样品中的待测物质与试纸条的抗体发生特异性的免疫反应而出现颜色变化，从而获得直观的测试结果[7-8]。免疫胶体金试纸条在无需额外试剂和设备的条件下即可快速完成检测，非常适用于野外检测工作的开展。如Selvarajan等[9]建立了可用于香蕉片花叶病毒检测的胶体金试纸条，并用于该病毒的田间检测工作。目前，已经建立了团头鲂(Megalobramaamblycephala)和铜色吸口鱼(Moxostomahubbsi)等淡水鱼类的Vtg胶体金试纸条，但是这两种试纸条的检出限分别为10和0.6 μg·mL-1，并不能满足环境雌激素当量为ng·L-1级别的野外检测需求，亟需开发更为灵敏的Vtg胶体金试纸条。
本研究以中国近海常见鱼种褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)为受试生物，利用高特异性、高亲和力的单克隆抗体与金纳米颗粒偶联开发了褐牙鲆Vtg的免疫胶体金试纸条。在对其特异性、灵敏度和稳定性进行评价的基础上，检测了其用于测定3种常见雌激素类污染物对褐牙鲆幼鱼血浆Vtg的诱导情况，进一步验证了该方法用于环境雌激素活性检测的可靠性，以期为中国海洋环境雌激素的快速检测提供简单、可靠的工具。
1.1 卵黄原蛋白的纯化与抗体制备
褐牙鲆Vtg抗原的纯化和抗体制备工作参照Zhang等[10]描述的方法。首先，利用凝胶过滤层析与离子交换层析相结合的方法从17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)诱导的褐牙鲆血浆中纯化获得Vtg蛋白，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和糖、磷、脂特异性染色鉴定后透析，并测定蛋白浓度。随后，利用纯化的Vtg腹腔注射小鼠，免疫3次后取血液，经离心获得褐牙鲆Vtg多克隆抗血清；
取脾脏细胞，与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合，经过至少3次筛选出稳定的阳性杂交瘤细胞系，获得褐牙鲆Vtg的单克隆抗体。利用Protein G亲和层析柱纯化对制备的Vtg单/多克隆抗体进行纯化，测定浓度后用于后续实验。
1.2 胶体金溶液的制备
根据Liu等[11]的方法制备胶体金溶液。将100 mL 0.01%氯金酸溶液加热至沸腾后，迅速加入1%柠檬酸三钠溶液1.6 mL，溶液由灰色转为酒红色，颜色稳定后继续加热10 min。待溶液冷却后，经0.22 μm微孔滤膜过滤，将制备好的胶体金溶液进行紫外光谱扫描(450～650 nm)和透射电镜分析。
1.3 胶体金-单克隆抗体的复合物制备
使用絮凝法确定胶体金标记的最佳抗体浓度和K2CO3的量：首先，向1 mL胶体金溶液中加入12 μL 0.2 mol·L-1的K2CO3溶液(过量)后，分别加入1～64 μg褐牙鲆卵黄原蛋白单克隆抗体，震荡30 min后，加入100 μL 10% NaCl溶液，静置2 h后，测定580 nm下的紫外吸光值确定最佳抗体浓度；
其次，向1 mL胶体金溶液中分别加入1～10 μL 0.2 mol·L-1的K2CO3溶液后，加入20 μg褐牙鲆卵黄原蛋白单克隆抗体(过量)，震荡30 min后，加入100 μL 10% NaCl溶液，静置2 h后观察颜色变化；
最后，将不同pH值标记的胶体金喷涂于金标垫，显色后确定最佳的K2CO3溶液。
随后根据上述测定结果，向1 mL胶体金中加入最佳蛋白量和K2CO3溶液，室温震荡30 min后，加入10% BSA封闭30 min，12 000 r/min离心30 min后弃上清，加入100 μL复溶液重悬胶体金。
1.4 胶体金试纸条的开发与优化
以玻璃纤维膜作为金标垫，以聚酯纤维素膜作为样品垫，将样品垫浸泡入样品垫处理液中(0.02 mol/L Tris-HCl、5%蔗糖和 2%Tween-20)，烘干后备用。使用喷金划膜仪(上海金标)将胶体金-单克隆抗体的复合物喷涂于金标垫上，将褐牙鲆Vtg多克隆抗体和羊抗鼠lgG抗体固定于硝酸纤维素膜(Millipore, USA)作为检测线(T线)和质控线(C线)，上述组件均置于37 ℃干燥。将干燥后的组件，按照样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水垫的顺序组装好(见图1(A))，利用斩切机纵向剪切成4 mm的条状并装入卡壳后，4 ℃保存备用。对胶体金试纸条T线和C线进行优化，将不同浓度的C线和T线包被液喷涂于硝酸纤维素膜，显色后观察最佳的C线和T线浓度(见图1(B))。
((A)Vtg免疫胶体金结构示意图;(B)检测结果:(+)阳性, 测试线上的红色密度与质控线相同;(-)阴性;(×)无效。(A)Diagrammatic sketch of colloidal gold monoclonal antibody conjugate-based immunochromatographic assay for Vtg(not to scale);(B)Determination of test results:(+)positive, red color density on test line is the same as that of control line;(-)negative;(×)invalid.)
将30 μL不同稀释浓度的褐牙鲆Vtg(1.95～1 000 ng·mL-1)滴加于样品垫位置，15 min后观察结果，并用Image J软件统计试纸条T线位置的光密度，以建立褐牙鲆Vtg的标准曲线。
1.5 胶体金试纸条稳定性
为检测夹心法胶体金试纸条的稳定性，将0、20和1 000 ng·mL-1的褐牙鲆Vtg溶液分别滴加于保存了1、30和90 d的胶体金试纸条上，观察结果。
1.6 双酚A、雌二醇和乙炔雌二醇对褐牙鲆Vtg的诱导情况
采用半静态水体暴露的方式对褐牙鲆成鱼(质量为(900±100)g, 体长为(35±5)cm)进行暴露。将褐牙鲆成鱼分别暴露于1、10和100 μg·L-1的17β-雌二醇、乙炔雌二醇(Ethinylestradiol, EE2)、双酚A(Bisphenol A, BPA)中，7 d后取血浆，在4 ℃下离心10 min，取上清，利用本研究建立的胶体金试纸条和此前建立的ELISA方法[4]检测血浆中Vtg的含量。
2.1 胶体金溶液的制备
紫外光谱扫描结果显示，本研究制备的胶体金溶液最大吸收峰为521 nm，在电镜下颗粒均匀、无聚团现象，平均粒径约为20 nm(见图2)，证明已成功制备出可用于抗体标记工作的胶体金颗粒。
图2 胶体金的紫外可见光谱(A)透射电子显微镜结果(B)
2.2 胶体金标记抗体的最佳PH值的优化
使用K2CO3对胶体金溶液PH进行优化，发现在加入不同量K2CO3的胶体金溶液均未发生聚沉反应(见图3(A))，随后将这些胶体金浓缩并喷涂于金标垫上。通过显色观察发现，当0.2 mol·L-1K2CO3加入量大于2 μL时，胶体金显色开始变浅，因此本研究选择0.2 mol·L-1K2CO32 μL作为胶体金标记抗体的最佳标记条件(见图3(B))。
图3 最佳K2CO3浓度优化后结果(A)和 K2CO3浓度对T线颜色变化的影响(B)
2.3 胶体金标记抗体的最佳抗体量的确定
最佳抗体量的结果如图4所示：当加入抗体量为1～8 μg时，胶体金溶液在加入NaCl后发生聚沉现象。当加入抗体量上升至16 μg时，胶体金溶液仍保留原来的颜色。测定胶体金溶液的OD580，发现当抗体量为16 μg时，OD值较小，且随着抗体量的增加，OD580变化较小，证明该抗体量为最佳的抗体标记量。
图4 Vtg单克隆抗体浓度对胶体金稳定性的影响(A)和抗体量优化后结果(B)
2.4 胶体金试纸条的优化
夹心法胶体金试纸条的T线显色强度随着包被在NC膜上的褐牙鲆多克隆抗体浓度(0.05～0.8 mg·mL-1)增大而增强(见图5)。然而，当T线处Vtg多克隆抗体浓度达到1.0 mg·mL-1时，反而导致C线颜色变弱。因此，0.8 mg·mL-1anti-Vtg多克隆抗体为T线最佳包被浓度。
图5 T线处最佳抗Vtg多克隆抗体浓度
夹心法胶体金试纸条C线显色强度随着羊抗鼠lgG浓度的升高而增强，当抗体浓度升高至8 mg·mL-1时，胶体金试纸条C线显色效果最好(见图6)，可以用于构建胶体金试纸条。
图6 C线处最佳羊抗鼠lgG浓度
2.5 夹心法胶体金试纸条的标准曲线的建立
以0.8 mg·mL-1褐牙鲆Vtg多克隆抗体为T线，以8 mg·mL-1羊抗鼠lgG为C线建立的夹心法胶体金试纸条灵敏度较高。经过Image J软件分析发现，该条件下制备的胶体金试纸条工作范围为15.7～1 000 ng·mL-1(R2=0.982 9), 肉眼检出限为7.8 ng·mL-1(见图7)。
图7 使用胶体金试纸条检测不同浓度Vtg标准溶液的肉眼观察结果(A)和使用Image J软件分析T线处的光密度定量结果(B)
2.6 夹心法胶体金试纸条的稳定性
用存放1、30和90 d的胶体金试纸条检测含有0、20和1 000 ng·mL-1的抗原稀释液，结果分别为阴性(见图8(A))、弱阳性(见图8(B))和阳性(见图8(C))，3个批次制备的夹心法胶体金试纸条显色结果并无明显差异。这证明本研究建立的胶体金试纸条检测的结果稳定性较强。
(A: 0 ng·mL-1 Vtg; B: 20 ng·mL-1 Vtg; C: 1 000 ng·mL-1 Vtg)
2.7 三种常见环境雌激素对褐牙鲆Vtg的诱导情况
利用胶体金试纸条检测双酚A(BPA)、雌二醇(E2)和乙炔基雌二醇(EE2)暴露后的褐牙鲆血浆发现：对照组中未检测到Vtg的产生(见图9(A));BPA和E2组中Vtg含量较少,T线显色较浅(见图9(B)、(C));EE2组中Vtg含量较高，T线显色清晰(见图9(D))。通过Image J软件定量分析发现BPA、E2、EE2处理组Vtg含量分别为(149.26±8.23)、(161.34±8.96)和(2 697.26±35.30)ng·mL-1(见图10)，与Zhang等[12]建立的电化学传感器和ELISA的定量结果相一致。
((A)对照组。(A)Control group.)
(代表差异极显著，P<0.01。
indecates that the difference is very significant, P<0.01.)
3.1 检测方法的选择
本研究以粒径为20 nm的胶体金作为标记物制备了快速检测褐牙鲆Vtg的胶体金试纸条。该试纸条以Vtg生物标志物为检测对象，可有效弥补气质联用和高效液相色谱等化学分析方法无法反应环境中雌激素活性的不足[13-14]。同时，该试纸条同重组酵母检测法[15]、酵母双杂交法[16]和新型菌株法[17]相比，有效节省了细胞培养的繁琐步骤。目前，最常用的Vtg定量方法为ELISA方法[4,10,18]，该方法包括包被、洗涤、孵育和显色等流程，至少需要14 h才能完成Vtg的检测[19]。相比之下，本研究开发的胶体金试纸条可在15 min之内完成样品检测，缩减了检测时间[20]。此外，与目前的商品化ELISA试剂盒相比[21]，该试纸条成本更为低廉，无需借助精密仪器，更适用于野外即时检测工作。
3.2 检测灵敏度
胶体金试纸条主要分为竞争法和夹心法[22]。本研究采用夹心法制备胶体金试纸条，利用抗体对抗原进行2次选择，以提高检测的准确性[23]。同时，为了提高试纸条的灵敏度，本研究使用具有较高亲和力的褐牙鲆Vtg单克隆抗体作为标记抗体，并对标记条件进行优化。研究表明，T线和C线处抗体的浓度对试纸条的构建至关重要，过高的抗体浓度可能会导致抗原的阻滞，而过低的抗体浓度会降低试纸条的灵敏度[24]。本研究对T线和C线抗体浓度进行了优化，发现优化后的胶体金试纸条检测范围为15.7～1 000 ng·mL-1，明显优于鳕鱼(Gadusmorhua, 300～87 200 ng·mL-1)和绿背鲽(Rhombosoleatapirine, 160～20 000 ng·mL-1)的Vtg ELISA[25-26]。同Maltais等[27]建立的铜色吸口鱼(Moxostomahubbsi)的Vtg胶体金试纸条检测范围(80～600 ng·mL-1)相近。该试纸条的视觉检出限为7.8 ng·mL-1，比杨方星等[28]建立的团头鲂Vtg胶体金试纸条检出限低了至少3个数量级，这表明本研究建立的胶体金试纸条具有良好的检测性能。
3.3 检测方法的实用性
为了验证建立的胶体金试纸条的可靠性，本研究分别选择了具有弱雌激素效应的BPA、以及典型雌激素E2和EE2暴露成年雄性褐牙鲆。利用胶体金试纸条测定暴露21 d后褐牙鲆体内的Vtg含量，发现结果与ELISA的测定结果相近，证明本研究建立的胶体金试纸条具有较高的准确性[4]。另外，本研究发现当E2浓度低至1 μg·L-1时，利用本研究建立的胶体金试纸条仍能有效的检测到Vtg的产生，这同马淑伟等[19]建立的金鱼Vtg ELISA相近，进一步证明本研究建立的胶体金试纸条具有较高的灵敏度。此外，将保存30和90 d的胶体金试纸条进行比对，发现检测结果与制备1 d的胶体金试纸条并无明显区别，表现出良好的稳定性。因此，本研究建立的胶体金试纸条可以用于环境雌激素活性的快速检测。
3.4 结语
本研究利用胶体金颗粒和Vtg单/多克隆抗体制备了褐牙鲆Vtg的夹心法免疫胶体金试纸条。通过对胶体金标记条件和T线、C线浓度进行优化后，该试纸条的检测范围为15.7～1 000 ng·mL-1，检出限为7.8 ng·mL-1，与目前常用的Vtg ELISA方法检测性能相近。本研究开发的胶体金试纸条可在15 min之内完成样品检测，使用非常便捷，为海洋环境雌激素活性的快速检测提供了一种可靠工具。
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