付加煜，朱诗宇，奚鸿杰，华迪，邱玲，林建国
1 南京医科大学药学院，南京 211166；
2 江苏省原子医学研究所 国家卫生健康委员会核医学重点实验室 江苏省分子核医学重点实验室
免疫治疗是恶性肿瘤治疗的重要手段。使用抗体阻断免疫检查点的免疫治疗已被证实在晚期恶性肿瘤中有效，被批准用于多种恶性肿瘤的治疗［1-5］。然而目前仅有少部分肿瘤患者可以从免疫治疗中受益，不当治疗还可诱发免疫相关不良反应（如肝炎、结肠炎等），甚至会引起患者死亡。因此，在免疫治疗早期评估患者的治疗反应，不仅可以最大限度地发挥免疫治疗的作用，还能为治疗不响应的患者及时寻找替代策略［6-9］。免疫治疗的疗效可以通过检测体内免疫相关生物标志物来进行评估［10-11］。颗粒酶B 是一种由细胞毒性T 细胞（CTLs）的细胞质颗粒释放的丝氨酸蛋白酶，在靶细胞中可诱导程序性死亡或凋亡［12-14］。当CTLs 识别目标细胞时，颗粒酶B被释放，进入目标细胞的细胞质后，触发Caspase 级联反应，并通过直接和间接的层压处理及激活、线粒体渗透等方式，最终导致肿瘤细胞死亡［15-17］。因此，颗粒酶B 不仅反映CTLs 在肿瘤区域的定位和表达水平，还直接反映CTLs 对肿瘤细胞的潜在杀伤能力，是一种可靠的免疫相关生物标志物［18］。准确检测体内颗粒酶B表达水平是免疫治疗疗效评估的关键。影像学技术能无创、实时、定量地进行全身动态成像［19-22］。靶向分子影像探针能够准确检测免疫治疗前后体内颗粒酶B的表达水平。目前关于颗粒酶B的分子探针主要分为近红外荧光（NIRF）探针和正电子发射断层扫描（PET）探针两类。NIRF 成像操作简便，受背景的自发荧光影响较小，可提供较为准确的显像结果，但是其组织穿透能力较弱［23］。PET显像具有组织穿透力强、灵敏度高、分辨率高等优点，与电子计算机断层扫描（CT）和核磁共振成像（MRI）联合成像时可提供更为准确的显像结果，不过PET 需要借助放射性核素标记分子探针，便捷性较差［24-26］。现就靶向颗粒酶B 的分子影像探针的作用机制及应用研究进展综述如下。
根据作用机制，靶向颗粒酶B 的NIRF 探针主要分为可激活类和自组装类。可激活类NIRF 探针是将荧光基团与靶向肽序列相连接，在探针结构末端引入荧光淬灭基团，或在靶向肽两端连接一对荧光共振对基团，使得探针起初处于荧光信号关闭的状态，随后在体内被颗粒酶B识别剪切靶向肽后，荧光信号开启。自组装类NIRF 探针是将靶向肽序列与荧光基团连接，通过点击缩合反应后自组装形成纳米颗粒淬灭荧光，酶剪切后解组装开启荧光，或在体内经酶切后自组装聚集增强荧光进行显像。
1.1 可激活类NIRF 探针CyGbPF和CyGbPP有学者通过在颗粒酶B 特异识别的多肽序列IEFD 和IEPD 上连接花菁染料（CyOH），构建了NIRF 探针CyGbPF和CyGbPP［27-30］。该类探针的作用机制是Cy-OH 在连接上IEFD 或IEPD 及对氨基苯甲醇（PABA）后，其氧原子供电子能力减弱，分子探针最初处于荧光淬灭状态，将底物序列剪切后，自毁基团PABA 离去使得淬灭的荧光重新被开启。CyGbPF和CyGbPP被注射进入体内后可被动靶向肿瘤，被肿瘤微环境中的颗粒酶B识别剪切，导致NIRF信号增强。
体外实验证实，两个荧光探针均具有较好的生物安全性和靶向特异性。研究者分别用NLG919、R848、BMS-1、Pexidartinib 和BEC五种免疫治疗药物对乳腺癌（4T1）小鼠进行治疗，在治疗过程中注射CyGbPF和CyGbPP进行显像以监测疗效，结果显示，免疫治疗后，肿瘤部位荧光信号明显增强，而其余组织部位荧光信号较弱。体外免疫荧光染色和流式细胞术分析也证实，探针在体内成像中的荧光信号强度也与其他免疫相关生物标志物如CD8+、CD4+受体存在相关性。此外，CyGbPF和CyGbPP还具有高肾脏清除效率，使得无创的光学尿液分析较免疫荧光染色更方便。CyGbPF和CyGbPP作为第一种能够实时成像和进行活体动物体内颗粒酶B 尿液分析的NIRF探针，在推进荧光成像在免疫治疗中的应用具有深远意义。
1.2 可激活类NIRF 探针GNR NGUYEN 等［31］在IEPD 两端连接一对荧光共振对，随后与纳米聚合主链PIMA 相连使其形成纳米聚集物，最终获得探针GNR。在颗粒酶B 存在的条件下，GNR 结构上的IEPD 会被剪切，造成分子结构断裂，从而使供体基团的荧光重新被开启，并通过荧光信号强度来反映颗粒酶B表达水平。由于实体瘤的高通透性和滞留效应，GNR 进入体内后会聚集在肿瘤部位，而在其他组织中则会被快速清除。该研究还在GNR 的结构上偶联PD-L1抗体，纳米颗粒聚集在肿瘤部位后，将阻断PD-L1/PD-1通路，可以同时实现对肿瘤的免疫治疗和疗效监测。
GNR在体内外均具有良好的颗粒酶B靶向特异性和生物相容性。有学者对荷瘤小鼠进行免疫治疗，发现对治疗响应的小鼠结直肠癌（MC-38）组织有明显的荧光信号开启和增强，而在对治疗不响应的小鼠黑色素瘤（B16/F10）组织中则没有检测到荧光信号，说明该探针能够有效区分治疗响应者和非响应者。此外，离体组织分析结果表明，探针在体内成像的荧光信号强度与颗粒酶B 表达水平高度一致。与肿瘤体积及形态监测相比，GNR 的影像结果可以提供更早、更全面的肿瘤整体免疫反应信息。该纳米探针也可在未来临床试验中偶联其他免疫药物，在进行免疫治疗的同时监测疗效。
1.3 自组装类NIRF 探针G-SNAT-Cy5 XIE 等［32］在一个多功能骨架TESLA上连接IEFD，设计了分子探针G-SNAT-Cy5，通过分子内点击缩合自组装策略来增强荧光信号进行成像。在被颗粒酶B识别剪切后，TESLA 骨架上的半胱氨酸基团与芳香腈发生点击缩合，形成分子内环化产物。由于疏水性和π-π相互作用，环化产物形成聚集体，从而延长探针在靶点部位的保留时间，以达到增强显像效果的目的。
有学者对结直肠癌（CT-26）小鼠进行抗PD-1 和抗CTLA4 联合治疗，采用G-SNAT-Cy5 监测疗效，结果显示，联合疗法引发了异质性反应，治疗小鼠出现了响应和非响应者。响应者仅在治疗的最初肿瘤体积有所增加，随后持续缩小，而未经治疗的小鼠和经治疗无响应的小鼠肿瘤则保持持续增长。该研究中，三组小鼠体内的CTLs 均被激活，但只有治疗响应小鼠的肿瘤中有明显的CTLs 浸润和颗粒酶B 活性。在无响应和未治疗组中，只在肿瘤最外侧一圈有明显的荧光信号，可能代表肿瘤微环境在逐渐排斥免疫细胞；
而在对治疗响应的小鼠肿瘤中则没有观察到该现象。与另外两个自组装荧光探针Dluciferin 和GBLI2 相比，G-SNAT-Cy5 虽然在总体上显示出了相似的分布，但其在肿瘤内荧光信号更强且对比度得到改善，这表明该探针在监测恶性肿瘤免疫治疗疗效及协调免疫治疗方面具有一定价值。
1.4 自组装类NIRF 探针Cy5.5-CBT-NPs XU等［33］设计合成的Cy5.5-CBT-NPs同样是基于半胱氨酸和氰基点击缩合自组装策略。与G-SNAT-Cy5 不同的是，该研究首先合成了一个小分子荧光探针Cy5.5-CBT，裸露出其结构上的1，2-氨基硫醇基团，与另一个Cy5.5-CBT 的CBT 部分点击缩合，形成环状二聚体产物Cy5.5-2CBT，随后通过分子间疏水相互作用和π-π 堆积形成纳米探针Cy5.5-CBT-NPs。纳米颗粒的荧光最初由于聚集作用是淬灭的，被颗粒酶B 识别剪切后会导致二聚体产物的断裂，造成纳米颗粒解组装，使荧光信号重新开启。
体外研究中，有学者通过透射电镜图像、荧光光谱、荧光寿命谱和HPLC 分析，证实了Cy5.5-CBTNPs 的还原诱导自组装和颗粒酶B 引发的解组装，并伴有荧光淬灭和开启。细胞成像结果表明，使用CD8+T 淋巴细胞对B16-OVA 肿瘤细胞进行治疗后，Cy5.5-CBT-NPs 能够实时、灵敏地检测CD8+T 淋巴细胞的反应。体内显像结果表明，Cy5.5-CBT-NPs能够对免疫治疗响应的肿瘤进行显示。体外免疫荧光染色进一步证实，开启的NIFR 荧光与CTLs 的肿瘤内浸润和颗粒酶B表达水平有相关性。由于颗粒酶B 的活性与CTLs 对肿瘤细胞的杀伤强度直接相关，因此，Cy5.5-CBT-NPs 可直接用来监测免疫治疗期间肿瘤微环境中CTLs的活性。
靶向颗粒酶B 的PET 探针设计思路是在靶向肽上连接标记基团以引入放射性核素，主要分为两类，分别是酶结合类PET探针和酶剪切类PET探针。酶结合类探针作用机制为：探针进入体内被酶识别后，结构上的靶向肽与颗粒酶B 结合，从而使放射性信号保留在该部位进行PET显像。酶剪切类探针作用机制为：探针在被颗粒酶B识别后，靶向肽序列会被其剪切，造成其结构断裂，随后通过与细胞膜结合或自组装等方式保留在靶部位进行成像。
2.1 酶 结 合类PET 探 针68Ga-NOTA-GZP 和［18F］AlF-mNOTA-GZP 研究者在IEFD 后连接小型灵活接头Gly-Gly-Gly，随后连接金属螯合剂1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸，以此合成NOTA-GZP。NOTA-GZP通过68Ga和18F标记引入放射性核素获得探 针68Ga-NOTA-GZP 和［18F］AlF-mNOTA-GZP［34-37］。68Ga 半衰期为68 min，18F 半衰期为109 min，二者均与短肽的快速药代动力学相匹配。体外酶抑制实验验证了NOTA-GZP 对颗粒酶B 具有高亲和力和高特异性，68Ga-NOTA-GZP 和［18F］AlF-mNOTA-GZP 均具有较高的放射性化学产率和放射化学纯度。在抗PD-1 单一疗法、抗PD-1 与抗CLTA-4 联合治疗的CT-26 荷瘤小鼠体内PET 显像研究中，68Ga-NOTAGZP 在两组小鼠肿瘤部位均有较高的摄取，且在联合免疫治疗组中摄取最高，而在未接受治疗组的肿瘤部位没有明显摄取。68Ga-NOTA-GZP 在肾脏和膀胱中的同样也存在高摄取，可能是由于其主要通过肾脏代谢。
有学者对结直肠癌CT-26、MC-38小鼠进行化疗联合免疫治疗后，注射［18F］AlF-mNOTA-GZP进行显像，PET-CT/MRI 图像的肿瘤定量分析显示，不同治疗组小鼠探针的摄取有明显差异，根据成像结果能够区分治疗应答者与无应答者。研究者在未治疗组、无应答者及未抑制肿瘤生长的治疗组中观察到［18F］AlF-mNOTA-GZP低摄取，而在成功抑制肿瘤生长的治疗组中观察到更高的摄取。此外，与CT-26小鼠肿瘤相比，在MC-38 小鼠肿瘤中观察到更高的［18F］AlF-mNOTA-GZP摄取，且未治疗组和无应答者的背景摄取量也更高。
上述研究结果表明，68Ga-NOTA-GZP 和［18F］AlF-mNOTA-GZP 均有很好的靶向颗粒酶B 的能力，可有效预测免疫治疗的疗效。然而，上述两种探针在肿瘤中的摄取较低，同时可能受肿瘤表型异常的影响，需要进一步阐明相关原因。
2.2 酶结合类PET 探针68Ga-grazytracer ZHOU等［38］根据IEPD设计并合成了PET探针68Ga-grazytracer，与NOTA-GZP 不同的是，68Ga-grazytracer 结构上含有一个有助于提高体内稳定性的刚性三环肽模拟支架和可以抑制与其他蛋白酶反应的非醛药效团。荷瘤小鼠模型研究结果显示，与68Ga-NOTA-GZP 相比，68Ga-grazytracer在荷瘤小鼠中显示出显著的肿瘤摄取并增强了成像对比度。这可能是由于刚性三环肽模拟支架和1，2，3-三唑药效团更耐水解和酶裂解，提高了68Ga-grazytracer在体内的代谢稳定性。学者们还进行了初步临床研究，在5 例肿瘤患者中，68Ga-Grazytracter的PET显像能够较好地监测免疫治疗效果。然而，由于招募患者数量有限，后续还需要进行更多的临床研究以提供更为全面和可靠的数据。
68Ga-grazytracer 在监测多种免疫疗法在不同肿瘤中的疗效方面有一定优势，在评价肿瘤对免疫治疗的响应方面效果优于18F-FDG。初步临床研究证实了68Ga-grazytracer PET 显像在肿瘤免疫治疗疗效监测中的应用价值，为未来进行更大规模的临床研究提供了基础。
2.3 酶剪切类PET 探针64Cu-GRIP B ZHAO 等［21］根据一种名为相互作用肽（RIP）的长链肽设计了一个靶向颗粒酶B 的PET 探针64Cu-GRIP B。GRIP B的具体结构是在IEPD 上连接一个与放射性同位素偶联的无毒抗菌肽（AMP），以及一段阻止AMP 转变为螺旋构象的肽链，这使得其能够保持直链。在被细胞外的颗粒酶B 剪切后，放射性标记的AMP 被释放，发生构象变化形成螺旋结构，并沉积在附近的细胞膜内，紧密结合到磷脂双分子层上。与上述两类短肽探针有所不同，GRIP B 使用放射性核素64Cu 进行标记以获得64Cu-GRIP B，64Cu 的半衰期为12.7 h，这与长链肽的药代动力学较为匹配。并且，该探针可在胞外被识别并剪切后结合在细胞膜上，不会进入细胞内。
64Cu-GRIP B 具有较高的放射性标记产率和纯度，与重组人颗粒酶B 孵育30 min 后会完全转变为剪切产物，同时在小鼠血清中也有较高的稳定性。探针在小鼠体内的血浆清除半衰期约为8 min，主要通过肾脏代谢。学者们对CT26 小鼠进行抗PD1 和抗CTLA4 联合治疗，治疗后注射64Cu-GRIP B，静态图像的感兴趣区分析显示，治疗组64Cu-GRIP B 的肿瘤摄取在注射后2 h已明显高于未治疗组，且24 h后依旧有明显的放射性积聚。通过动态PET采集图像得到的时间—活性曲线显示，治疗组小鼠肿瘤中64Cu-GRIP B 积累迅速，注射后10 min 内达到5% ID/g。然而，未治疗组小鼠肿瘤中的放射性示踪剂摄取量明显较低，且不会随时间变化。注射后2 h的生物分布研究结果显示，治疗组小鼠脾脏摄取也显著增加，这与全身免疫对T 细胞的刺激有关。放射自显影和免疫荧光结果显示，组织中探针的结合区域与颗粒酶B 和T 细胞标志物CD3 的表达一致。此外，由于该探针在淋巴组织中也可以显示免疫细胞激活，研究者还将该探针应用到了肺部炎症模型的相关研究中。以上结果表明，64Cu-GRIP B 可以通过PET 成像对体内颗粒酶B 的活性进行评估，有望在未来应用于临床试验。
总之，颗粒酶B 检测为恶性肿瘤免疫治疗早期疗效评估提供了可靠的依据，利用分子影像学技术可实现实时、无创监测，有助于及时调整治疗方案。上述靶向颗粒酶B 的NIRF 探针和PET 探针均具有较好的靶向特异性，而PET 探针由于成像方式的优势，其组织穿透力强，成像结果更为准确，更适用于临床转化。但是这些分子探针也存在一定不足，如在靶部位的摄取较低、体内不稳定、易受体内其他环境干扰等，对检测结果的准确性有一定影响。总的来说，这些相关研究为免疫治疗疗效评估提供了宝贵经验。未来还会有更多靶向颗粒酶B的分子探针出现，为肿瘤免疫治疗疗效的精准评估提供思路。
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