[摘要] 目的 探讨用MTT法测定大肠癌细胞对化疗药物体外敏感性，研究大肠癌药敏的异质性和个体化疗的可行性。方法 用MTT法检测40份大肠癌标本对氟尿嘧啶（5-FU）、奥沙利铂（L-OHP）、伊立替康（CPT）单药应用、两药及三药（全量或半量）联合应用的敏感性。结果 不同标本的药物敏感性存在明显差异，单药中最有效的药物依次为伊立替康、奥沙利铂和氟尿嘧啶，敏感率分别为35.0%、27.5%和20.0%；两药联合应用均优于各自单药的抑制效果（P＜0.05），伊立替康联合奥沙利铂弱于伊立替康或奥沙利铂与氟尿嘧啶联合的抑制效果（P＜0.05）；三药联合应用的抑制效果显著优于两药联合（P＜0.05），三药全量及半量联合应用效果差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 大肠癌对抗癌药物的敏感程度普遍较低，且存在明显异质性。试验结果与临床治疗经验比较一致，MTT可用于为大肠癌患者选择合适的化疗药物。由氟尿嘧啶、奥沙利铂及伊立替康的联合应用具有高效协同抑制大肠癌细胞的作用，可为临床难治性和复发性大肠癌患者的化疗提供参考。
[关键词] MTT法；大肠癌；药物敏感性
[中图分类号] R446.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）22-26-03
Clinical Application and Evaluation of Chemosensitivity of Human Colorectal Cancer Determined by MTT Assay in Vitro
YANG Leilei1 DAI Yuechu2 DONG Milian2 YE Pubo1 LIAO Wei1 MEI Tong1
1.Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China；2.Affilicated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical College，Linhai 317000，China
[Abstract] Objective To investigate the heterogeneity of chemo sensitivity in colorectal cancer using an MTT assay and the feasibility of individual chemotherapy. Methods The growth-inhibition effects of irinotecan（CPT），oxaliplatin（L-OHP） and fluorouracil（5-FU），single drug，two or three drugs on 40 human colorectal carcinoma cells were observed by MTT assay. Results There were considerable differences in chemo sensitivity between individuals. The most active single drugs in the assay was identified as irinotecan（CPT），oxaliplatin（L-OHP）and fluorouracil（5-FU）；35.0%，27.5% and 20.0% of specimens showed sensitivity to them，The inhibitory rates of any two drugs were significantly higher than those in single drug group（P＜0.05）．The growth-inhibition effect of CPT combined with L-OHP was lower than that of CPT or L-OHP combined with 5-Fu（P＜0.05）. The growth-inhibition effect of the three drugs combination was significantly enhanced compared with regiment of two drugs combination chemotherapy（P＜0.05）． Furthermore，whole-dose and half-dose combination of 3 drugs reached similar cell growth inhibitory rate（P＞0.05）. Conclusion There was the heterogeneity of the in vitro chemosensitivity in colorectal cancer. The use of the MTT assay provides a method of selecting appropriate anti-cancer drugs in colorectal cancer. The regiment of three drugs in the 5-FU+L-OHP+CPT can synergistically inhibit the proliferation of human colorectal carcinoma cells，which provided reference for the chemotherapy of refractory and recurrent colorectal carcinoma patients．
[Key words] MTT assay；Colorectal carcinoma；Chemosensitivity
化疗是临床治疗恶性肿瘤的重要手段之一，大肠癌中、晚期患者术后需辅助化疗。大肠癌普遍存在化疗耐药问题，经验化疗因用药缺乏客观依据给患者带来许多痛苦。为了提高用药的针对性和敏感性，在化疗前进行体外抗肿瘤药敏性测定显得尤为重要[1，2]。利用癌细胞原代培养进行药敏试验可针对性地指导治疗由于大肠癌对化疗药物敏感性存在的个体差异。因此，如何能为患者在化疗前筛选出敏感药物，实现个体化治疗，是当前肿瘤学界的主要研究方向。本研究用MTT法对40份新鲜大肠癌手术标本进行了体外药敏检测，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源
收集本院2010年3～6月大肠癌手术患者（男23例，女17例；年龄18～88岁，中位年龄53岁）标本40份，经病理证实均为原发肿瘤，且术前未经放化疗或免疫治疗。其中结肠癌12份（腺癌9份，黏液腺癌2份，印戒细胞癌1份），直肠癌28份（腺癌25份，黏液腺癌2份，乳头状管状腺癌1份）；TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期24份，Ⅲ期14份，Ⅳ期2份。
1.2 药品与试剂
1.2.1 药品 依据文献报道血浆峰值药物浓度（PPC）和预实验结果确定伊立替康、奥沙利铂基准实验浓度（BTC）分别为12.0g/mL、10.0g/mL。联合用药时采用伊立替康终浓度为12.0g/mL（全量）和6.0g/mL（半量）、奥沙利铂为10.0g/mL（全量）和5.0g/mL（半量）。
1.2.2 试剂 培养液RPMI-1640（美国Sigma公司）、10％十二烷基硫酸钠（SDS长沙科泰科研试剂有限公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）、四甲基氮唑蓝MTT（美国Sigma公司）、胶原酶（美国Sigma公司）、胰蛋白酶（美国Sigma公司）。
1.3 实验仪器
全自动酶标仪statFax2100（美国）。CO2培养箱（FORMA 3111美国）。
1.4 体外药敏试验
无菌取新鲜大肠癌手术标本，在含抗生素培养基中浸泡20min，剪成0.5～1.0mm3碎块，置50mL离心管中，加10mL含混合消化酶的培养基，37℃消化1h。200目筛网过滤，获单细胞悬液，用1640培养基洗2次。台盼蓝染色，计活肿瘤细胞数。大肠癌细胞培养于含20％胎牛血清的1640培养基中，以0.25％胰酶消化后制成1×105/mL细胞悬液，于2个96孔板中每孔接种200μL，37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24h后，于96孔板中加入药物，测定细胞生长。96孔板分为空白组、对照组和药物实验组。药物实验组又分为：①单药组，伊立替康全量、奥沙利铂全量、氟脲嘧啶全量；②两药联合化疗组，伊立替康全量+奥沙利铂全量、伊立替康全量+氟脲嘧啶、奥沙利铂全量+氟脲嘧啶；③三药联合化疗组，伊立替康全量+奥沙利铂全量+氟脲嘧啶、伊立替康半量+奥沙利铂半量+氟脲嘧啶、伊立替康全量+奥沙利铂半量+氟脲嘧啶、伊立替康半量+奥沙利铂全量+氟脲嘧啶。每组设4个复孔。单药组加入各自浓度药物100μL；2种药物联合用药时采用1�1方案，使药物浓缩1倍后各加50μL，使每孔的药物浓度、体积和总量不变；3种药物联合应用时，采用1�1�1方案，使药物浓缩2倍后各加25μL，再补加25μL培养基以使药物浓度及总量不变。置于37℃、5％CO2培养箱48h后，每孔加入MTT 20μL，继续培养4h，弃培养液，每孔加DMSO 150μL，充分溶解10min。全自动酶标仪（测定波长490nm、参比波长630nm）测定各孔光密度值（OD值），空白组OD＜0.005、实验组OD＞0.1为有效实验。
1.5 数据处理
计算平均抑制率（IR），IR＝[1－（用药组平均OD值－空白组平均OD值）/（对照组平均OD值－空白组平均OD值）]×100％。IR标准采用1978年全国抗癌药物会议制定的《肿瘤药物通用指标》IR＜30％为不敏感，归阴性；30％＜IR＜50％为敏感；IR＞50％为中度敏感，归阳性。
1.6 统计学处理
用SPSS13.0统计软件处理，计数资料采用行乘列的卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
不同标本的药物敏感性存在明显差异，单药中最有效的药物依次为伊立替康、奥沙利铂和氟尿嘧啶，敏感率分别为35.0%、27.5%和20.0%；两药联合应用均优于各自单药的抑制效果（P＜0.05），伊立替康联合奥沙利铂弱于伊立替康或奥沙利铂与氟尿嘧啶联合的抑制效果（P＜0.05）；三药联合应用的抑制效果显著优于两药联合（P＜0.05），三药全量及半量联合应用效果差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。
3 讨论
MTT法是一种近年来研究较广泛的方法，该方法由Mosman于1983年首创。国内外学者采用MTT法在肿瘤体外药敏试验方面积累了一定的临床和实验资料，认为该法是简便、快捷、经济的药敏方法，临床相关性较高[3-5]。不仅对临床个体化疗有重要指导意义，而且在研究抗癌药物相互作用、耐药修饰剂对细胞毒性的影响、体外新药的筛选以及最终实现个体化疗方面都有深入研究价值。Tomita K等研究表明，体外药敏试验与体内临床用药不敏感（阴性结果）相符合率均为90％。由此表明，不论是真阳性及真阴性符合率，应用具有简便、快速、敏感、结果可靠等优点的MTT法试验，对于制定临床肿瘤合理化疗策略具有指导意义。
本检测结果显示，不同患者大肠癌标本对化疗药物的敏感程度有明显的异质性。3份未检测到敏感药物及药物组合，4份检测到对所有药物及药物组合均敏感。提示化疗前进行体外药敏检测，可筛选出患者相对敏感的药物，以避免盲目用药的损害。此外，试验显示，大肠癌对单药的敏感性普遍较差，对CPT、L-OHP和5-FU的中度敏感率分别为10.0%、7.5%和2.5%。此结果与大肠癌属化疗低度敏感的临床观察相符合。现在，临床上多用2种或2种以上的药物进行联合化疗，但发表的体外药敏试验结果多是单药试验结果，这与临床实际应用有较大距离。因此，我们尝试体外检测临床常用的三种药物氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康单药应用、两药及三药（全量或半量）联合应用的敏感性。结果显示，不同标本的药物敏感性存在着明显差异，单药中有效的药物依次为伊立替康、奥沙利铂和氟尿嘧啶，敏感率分别为35.0%、27.5%和20.0%；两药联合应用均优于各自单药的抑制效果（P＜0.05），伊立替康联合奥沙利铂弱于伊立替康或奥沙利铂与氟尿嘧啶联合的抑制效果（P＜0.05）；三药联合应用的抑制效果显著优于两药联合（P＜0.05），三药全量及半量联合应用效果差异无统计学意义（P＞0.05）。
在本实验中，伊立替康、奥沙利铂及氟脲嘧啶三药联合显示了强大的抗肿瘤活性，明显优于伊立替康或奥沙利铂与氟脲嘧啶的两药联合的效果。Falcone等[5]进行的一项Ⅲ期临床研究表明，应用伊立替康、奥沙利铂及氟脲嘧啶三药联合的FOLFOXIRI方案治疗晚期转移性大肠癌显示出较好的抗肿瘤活性，与伊立替康、氟脲嘧啶二药联合FOLFIRI方案相比在RR、PFS和OS均取得明显的改善。
国外也有研究表明，三者联合应用可能通过协同作用而增强抗肿瘤效果。本实验显示，半量与全量的三药联合组内差异不显著，既半量联合可取得全量联合应用相同的效果。这种半量的化疗方案可以在保证疗效的前提下减少毒副作用，为临床应用三药小剂量化疗提供了实验依据。但我们检测药敏的病例数较少，尚需更多的数据和进一步研究，才能为临床应用提供更有价值的试验依据。
[参考文献]
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[2] Untch M，Ditsch N，Langer E，et al．Chemosensitivity testing in gynecologic oncology―dream or reality?[J]．Recent Resuits Cancer Res，2003，161：146-158．
[3] Cao W，Yang W，Lou G，et al. PhaseⅡtrial of infusional fluorouracil，leucovorin，oxaliplatin，and irinotecan（FOLFOXIRI）as first-line treatment for advanced gastric cancer[J]. Anticancer Drugs，2009，20（4）：287-293.
[4] Douillard JY，Siena S，Cassidy J，et al. Randomized， phaseⅢ trial of panitumumab with infusional fluorouracil，leucovorin，and oxaliplatin （FOLFOX4）versus FOLFOX4 alone as first-line treatment in patients with previously untreated metastatic colorectal cancer：the prime study[J]. J Clin Oncol，2010，28（31）：4697-4705.
[5] Falcone A，Ricci S，Brunetti I，et al. Phase Ⅲ trial of infusional fluorouracil，leucovorin，oxaliplatin，and irlnoteean（FOLFOXIRI）compared with infusional fluorouracil，leucovorin，and irinoteean（FOLFIRI）as first-line treatment for metastatic colorectal cancer：the Gruppo Oncologico Nord Ovest[J]．J Clin Oncol，2007，25（13）：1670-1676.
（收稿日期：2011-05-30）