[摘要] 目的:制备全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)前体脂质体,并测定前体脂质体中磷脂的过氧化值(POV)。方法:采用山梨醇为固化载体,改良旋转蒸发-载体吸附法制备ATRA前体脂质体。水化后,采用微柱离心法测定全反式维甲酸脂质体的包封率。以丙二醛(MDA)法测定磷脂的过氧化值来表示在制备全反式维甲酸前体脂质体过程中磷脂的过氧化程度。结果:ATRA前体脂质体的包封率为84.98%。制备前后磷脂的过氧化值分别为0.080和0.089。结论:该方法操作简单易行,适合实验室范围制备前体脂质体。且在制备前后,磷脂的过氧化值差为0.009,说明磷脂在制备过程中比较稳定。
[关键词] 全反式维甲酸;前体脂质体;包封率;过氧化值
[中图分类号] R943 [文献标识码]C [文章编号]1674-4721(2010)05(b)-114-01
全反式维甲酸(all trans retinoic acid, ATRA)是维生素A类化合物,生物利用度为50%,血浆半衰期短,达峰时间60～210 min,其后血药浓度迅速下降,血浆半衰期30 min[1]。为了提高ATRA的口服生物利用度,增强ATRA在胃肠道中的稳定性,并克服脂质体存在诸多不稳定的因素,如聚集、沉降、融合,且磷脂易水解和氧化,现采用山梨醇为载体,将ATRA制备成前体脂质体,使脂质体固化,有利于临床的普及和应用[2]。
1 仪器与材料
高效液相色谱仪(日本岛津);紫外分光光度计(南京东迈科技有限公司);旋转蒸发仪(上海医械专机厂);台式高速离心机(上海医分仪器制造有限公司)Sephadex 50(美国Pharmacia公司);维甲酸原料药(山东良福制药有限公司);口服大豆磷脂(上海太伟药业);胆固醇(天津博迪化工有限公司);硫代巴比妥酸(中国上海化学试剂公司),三氯乙酸(天津科密欧化学试剂开发中心)。
2 方法和结果
2.1 分析方法的建立
2.1.1 色谱条件色谱柱:C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇0.05 mol/L,磷酸二氢铵(90∶10,v/v);流速:1.0 ml/min;柱温:室温;紫外检测波长:348 nm;进样量20 μl。方法学考察结果表明:在本色谱条件下,脂质体中的辅料对ATRA的测定无干扰。
2.1.2 线性关系的确定 精密称取全反式维甲酸对照品,用甲醇溶解,配制成体积浓度为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0 μg/ml系列溶液。按上述色谱条件进样,以峰面积和浓度进行线性回归,得回归方程A=3.31×105C+543.5(r2=0.99 8),表明在0.025~1.0 μg/ml浓度范围内线性关系良好,且精密度和回收率均符合分析标准。
2.2 全反式维甲酸前体脂质体的制备
按照文献报道的方法[2],制备全反式维甲酸前体脂质体。具体步骤如下:称取适量山梨醇置于茄形瓶中,50℃旋转蒸发,使山梨醇挥去吸附的水分。按质量比20∶1∶1,精密称取口服大豆卵磷脂、胆固醇、全反式维甲酸无水乙醇,使脂质完全溶解。分步喷于山梨醇颗粒,旋转蒸发挥去乙醇,得全反式维甲酸前体脂质体。
2.3 脂质体包封率的测定
称取全反式维甲酸前体脂质体300 mg,5 ml重蒸水水化,轻微搅拌10 min得脂质体混悬液。采用微柱离心法测定全反式维甲酸脂质体的包封率[3]。制备5 ml微柱,依次用PBS(pH 6.8)和0.5 ml空白脂质体饱和微柱,1 500 r/min离心5 min,弃去洗脱液。取0.3 ml全反式维甲酸脂质体三份上样,以等体积PBS(pH=6.8)洗脱,1 500 r/min离心5 min,连续操作3次。平行测定三批。将离心液用甲醇破坏,流动相定容。按“2.1.1”中色谱条件进样,按照E(%)=Wdrug/Wtot×100计算脂质体的包封率。
2.4 全反式维甲酸前体脂质体中磷脂过氧化值的测定
磷脂的氧化程度可通过其过氧化值来评价。本文采用丙二醛法测定磷脂的过氧化值。具体测定方法如下:取三氯醋酸(TCA)30 g,硫代巴比妥酸(TBA)0.75 g,加0.25 mol/L盐酸200 ml,温热至溶解得TTH试剂。精密量取1.0 ml水化后脂质体混悬液,于10 ml具塞试管中,加入5 ml TTH试剂,混匀。于100℃沸水中反应30 min,冷却至室温,加入4.0 ml TTH溶液,摇匀,于4 000 r/min离心5 min,于535 nm处,以TTH为空白测定吸光度A,即为过氧化值。
3 讨论
前体脂质体是指将脂质吸附于极细的水溶性载体上,以增加脂质分散的表面积。制备前体脂质体常用的载体有山梨醇、乳糖、甘露醇、蔗糖等,其中以山梨醇的效果最好。这主要是由于山梨醇具有多孔性结构,脂质载量大,且水中易溶,水化时分散性较好[5],故最终选择山梨醇为载体。本文成功地制备了稳定的、包封率较高的ATRA前体脂质体,且制备工艺简单,易于工业生产。
[参考文献]
[1]杨静文,邓英杰,李宝齐,等.全反式维甲酸脂质体的制备及体外评价[J].中国新药杂志,2007,16(15):1202-1205.
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[3]王秀敏,邓英杰,郝艳丽,等.微柱离心-气相色谱法测定β-榄香烯脂质体包封率[J].沈阳药科大学学报,2004,21(6):416-419.
[4]雷国锋,邓英杰,张丽娜,等.流化床包衣法制备灯盏花素前体脂质体的研究[J].中草药,2006,37(6):843-846.
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(收稿日期:2010-04-13)