[摘要] 目的：为提高灰树花多糖的提取率，本文用超声波-微波协同提取仪优选灰树花多糖提取的最佳工艺。方法：以时间、液流比和温度作为提取的变量因素，从中优选出最佳的提取条件。结果：提取温度90℃，时间10 min和液料比为30∶1为本文灰树花多糖超声波-微波协同仪提取法的最佳条件。结论：超声波-微波协同提取仪优选灰树花多糖提高了灰树花多糖的提取效率、提取纯度，缩短提取时间，明显降低提取成本，适合大规模生产，为市场的开发开辟新的提取手段。
[关键词] 超声波-微波；提取；灰树花多糖
[中图分类号] R283[文献标识码] B [文章编号] 1674-4721（2011）02（c）-124-03
Ultrasound-microwave technology of extracting polysaccharide from Grifola frondosa
JIANG Xiaohan, XU Qing, QIU Jianbo, LIU Hongmei
(Department of Pharmaceutical, Guangdong Food and Drug Vocational-technical School, Guangdong Province, Guangzhou 510663, China)
[Abstract] Objective: To raise the extract rate of Maitake polysaccharide, we used the ultrasonicwave- microwave equipment to select an optimum condition of extracts Maitake polysaccharide. Methods: The optimum condition of extractsting Maitake polysaccharide was selected from three variable factors, extract temperature, extract time and liquid ratio. Results: The best extraction conditions for Maitake Polysaccharide were 90℃, 10 min and 30∶1 with ratio liquid to solid. Conclusion: The extract method of the ultrasound-microwave instrument improved the efficiency, purity of extraction and saved time and costs of extraction, significantly. The extract means is suitable for mass production and open up new market development for the extraction means.
[Key words] Ultrasound-microwave technology; Extraction; Maitake polysaccharide
灰树花（Grifolafrondosa）又名贝叶多孔菌、栗子蘑、云蕈、莲花菌等，隶属于担子菌纲 、多孔菌目、多孔菌科 、多孔菌属[1]。灰树花是一种食、药两用菌。灰树花含有丰富的营养物质，据农业部质检中心和中国预防医学科学院营养雨食品卫生研究所检验，灰树花干品中含蛋白质32%，其中含18种氨基酸，总量近20%，碳水化合物50%及多种维生素和微量元素，对改进食物构成，平衡营养成分及提高机体对蛋白质的利用率具有重要作用[2]。同时灰树花还是一种十分珍贵的药用真菌，其中含有的多糖是一种重要生物活性物质，大量研究表明，灰树花多糖具有增强免疫功能、抑制肿瘤、抗病毒、稳定血压、平衡血糖、改善脂肪代谢等生理活性，且无毒副作用[3]。
为了高效地获取灰树花多糖，近年来先后采用水浸提取法[4]、超声波法[5]等对灰树花的多糖进行提取，尽管取得了较好的结果。但是其回收率和纯度尚不满意。因此，本文首次采用超声波-微波协同提取仪提取灰树花多糖，并将其与常规的热水浸提法进行比较。
1 材料与方法
1.1 材料
灰树花菌丝体：液体深层培养灰树花，收集菌丝体，烘干，粉碎，过200目筛备用。化学试剂：分析纯级苯酚、葡萄糖、硫酸等。试验仪器：CW-2000型超声-微波协同提取仪: 上海新拓微波溶样测试技术有限公司；DFT-250手提式高速中药粉碎机：上海新诺仪器设备有限公司；101-1型数显电热恒温鼓风干燥箱：金坛市友联仪器研究所；752型紫外分光光度计：广州北锐精密仪器有限公司；CN090型离心机：广州北锐精密仪器有限公司；RE5299型旋转蒸发仪：上海科兴仪器有限公司；HH-4型数显温水浴锅：金坛市友联仪器研究所；BP221S电子天平：德国赛多利斯。
1.2 试验方法
1.2.1 灰树花多糖提取工艺菌丝粉末→加入蒸馏水，搅拌均匀→调pH→超声波-微波协同提取→过滤→真空浓缩至原体积的1/3→醇沉→离心→真空冷冻干燥→水溶性粗多糖。
1.2.2 葡萄糖标准曲线的制备精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品25 mg，置于250 ml容量瓶中，加蒸馏水水溶解并稀释至刻度，配成浓度为0.1 mg/ml的葡萄糖标准溶液。然后分别吸取葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 ml于8只带塞试管中，加蒸馏水至总体积为1 ml。空白对照管为1.0 ml蒸馏水。每管依次加入5％苯酚溶液1 ml、硫酸5 ml。迅速摇匀，室温下放置20 min。用分光光度计于490 nm处测定吸收度。将测得值以葡萄糖溶液浓度C（mg/ml）为横坐标。吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为：
A=0.939 7C-0.051 2，r=0.998。
1.2.3 灰树花多糖测定计算方法按照绘制标准曲线同样的方法测定吸光度计算灰树花多糖含量。灰树花多糖含量的计算公式为：
多糖提取率（％）=×100%
1.2.4 超声波-微波协同提取灰树花多糖的单因素试验超声波-微波协同提取灰树花多糖提取工艺的优化，主要包括提取温度、提取时间、液料比3个主要因素。针对这几个因素，分别在保证其他因素相同的条件下进行单因素试验，考察各因素对灰树花多糖得率的影响，选择最佳的提取工艺条件。
1.2.5 超声波-微波协同提取灰树花多糖提取工艺参数正交设计为进一步优化灰树花多糖的提取条件，根据单因素试验的结果，选取提取温度、提取时间、液料比相作为考察因素，以灰树花多糖提取率为考核指标，采用正交设计L9（34）进行优化试验。并对试验结果进行处理，处理组合见表1。从而筛选出经济实用、便捷高效的多糖提取工艺参数。
1.2.6 灰树花多糖提取效果的评价以常规热水提取工艺作为超声波-微波协同提取灰树花多糖提取效果的对照依此评价其实用性。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 不同提取温度对灰树花多糖提取率的影响在恒温条件下，将CW-2000型超声波－微波协同提取仪的超声波功率设置为50 W、微波功率设置为自动，反应时间为5 min，液料比为40∶1。仅改变温度条件（50～100℃）时多糖的提取率随温度的增高而增加。但温度过高多糖得率略有下降，可能是过高的增加温度使部分多糖水解，这与大多数多糖提取工艺研究结果一致（图1）。由图1可见其最佳提取温度为90℃。
2.1.2 不同提取时间对灰树花多糖提取率的影响将CW-2000型超声波-微波协同提取仪的超声波功率设定为50 W、微波功率设定为自动，反应温度设定为90℃，液料比为40∶1。在此条件下，多糖的提取率在10 min内多糖得率提高比较明显，以后增加趋于平缓。这表明，目的产物浸出过程与时间密切相关，时间过短，产物溶解不充分，但时间过长，又会引起产物结构的变化进而使得率降低。由图2可见其最佳提取时间为10 min（图2）。
2.1.3 不同液料比例对多糖提取率的影响将CW-2000型超声波-微波协同提取仪的超声波功率设定为50 W、微波功率设定为自动，反应温度设定为90℃，反应时间为10 min，液料比为10∶1~60∶1。由图3可见，在此条件下，灰树花多糖的提取率随提取液料比的增加而提取率明显增加，当液料为10∶1~30∶1区间，提取率升高与液料比增加呈正相关，当液料比继续增加则提取率不随液料比增加而增加，由液料比30∶1开始，提取率呈现平台期。因此，液料比的最佳比为30∶1。
2.2正交试验
为了确定各因素间的相互作用对多糖提取效果的影响，在单因素试验的基础上，采用正交设计表L9（34）进行优化试验（表1）。正交试验方差分析结果表明（表3），提取时间的影响达到了显著水平。根据表2的正交试验直观分析，可以判断出，3个因素对多糖提取率的影响依次为时间>液料比>温度。灰树花多糖提取的最佳工艺参数为A2B2C2，即提取温度90℃、时间10 min、液料比30∶1。按正交试验得到的最佳提取条件试验3次，灰树花多糖得率分别是11.93%、10.95%、11.29%，平均值为11.39%。
2.3 超声波-微波协同提取与常规热水提取工艺的比较
由不同浸提温度、时间和液料比对多糖提取率的影响试验表明，常规热水浸提法获取灵芝多糖优选的最佳工艺参数分别为浸提温度90℃、时间2 h、液料比30∶1、提取2次。
为显示超声波-微波协同提取法的优势，我们将该法与常规的热水浸提法提取灰树花多糖的提取率进行比较。比较方法是：按正交试验法得到的最佳超声波－微波协同提取条件和常规热水浸提法对灰树花多糖进行提取，然后比较此两种方法对灰树花多糖提取率的影响，结果见表4。
3 结论
采用超声波－微波协同提取法提取灰树花多糖优选的最佳工艺条件为提取温度90℃、时间10 min、液料比30∶1，提取率为11.39％。
超声波－微波协同提取法与常规热水提取工艺相比。提取时间大幅缩短，仅为原来的1/24，所得多糖产率也有一定提高，同时还能有效降低用水量，节约水资源。
超声波－微波协同法将振动超声与开放式微波两种作用方式相结合。充分利用超声振动的空化作用以及微波的高能作用，使样品各点内受到的作用一致。降低目标物与样品基体的结合力，加速目标物从固相进入溶剂的过程。与常规热水提取工艺相比较，超声波-微波协同提取最显著的特点是缩短提取时间，提高灰树花多糖提取率，从而显著降低成本。
选择何种技术作为灰树花多糖的提取方法和工艺，必须根据其目的、灰树花原料的综合利用以及提取物终端产品的形式等综合因素考虑，同时实验室的结果尚有待于生产实践应用和检验。
[参考文献]
[1]郭家瑞,王卫国,李磊,等.灰树花研究概述[J].食用菌,2010,(4):1-2.
[2]Wang ZC.Ecosytem condition and medical value of Grifola frondosa[J].Edible Fungi China,1998,17(6):39-40.
[3]茅仁刚,洪筱坤.灰树花活性多糖的研究进展[J].中草药,2003,34(2):2-5．
[4]崔凤杰,许泓瑜,舒畅,等.响应曲面法优化灰树花水溶性多糖提取工艺的研究[J].食品科学,2006,27(4):142-146.
[5]安金双,王迪,马士淇,等.响应面法优化灰树花中多糖超声波提取工艺的研究[J].食品研究与开发，2008,29(6):11-15.
（收稿日期：2010-12-24）