褚宏伟，郑诗颖，赵群，赵宝锋，梁振，张丽华*，张玉奎
（1．中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，国家色谱研究分析中心，辽宁 大连 116023；
2．大连理工大学 张大煜学院，辽宁 大连 116024；
3．中国科学院大学，北京 100049）
膜蛋白质作为细胞膜结构和功能的主要承担者，参与分子转运、信号转导和细胞间交流等生物学过程［1］。目前约60%的药物靶标均为膜蛋白质［2-3］。其功能的发挥大多依赖与其他蛋白质相互作用形成的膜蛋白质复合物（Membrane protein complexes，MPCs）［4］。除鉴定蛋白质种类并研究其含量的动态变化外，解析蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interactions，PPIs）也是理解细胞生物过程的重要信息来源［5-7］。由于大多数膜蛋白质的丰度低，且疏水性强，使得对MPCs的过表达和纯化面临诸多挑战。因此亟需发展既能从细胞中直接高效提取MPCs，且能维持PPIs稳定性的方法［4，8］。本文针对MPCs的提取方法及其应用进展进行综述，并对其发展前景加以展望。
表面活性剂是一类具有疏水和亲水基团的两亲性分子，可通过自组装形成胶束，进而模拟脂质双分子层与蛋白质的疏水区结合，从而实现MPCs的高效提取［9-10］。然而，为确保在提取过程中复合物结构的完整性，目前多采用比较温和的表面活性剂。
以聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P-40，NP-40）和n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside，DDM）为代表的非离子型表面活性剂，能破坏脂类-脂类和脂类-蛋白质间的相互作用但不破坏PPIs，常被用于MPCs的溶解和提取［11］。Zheng等［12］使用NP-40裂解液对Rat-2细胞中表皮生长因子受体（EGFR）复合物提取后进行免疫共沉淀-质谱（co-Immunoprecipitation-mass spectrometry，co-IP-MS）分析，鉴定到EGFR复合物中41种相互作用蛋白，参与蛋白质磷酸化、脂质代谢和内吞作用等多条信号通路。Tian等［13］采用NP-40裂解液提取细胞培养条件下稳定同位素标记技术（Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）标记的Jurkat细胞，结合co-IP-MS分析，构建膜蛋白质CD28的相互作用网络和信号通路，鉴定到28种CD28的相互作用蛋白，其中超过50%的蛋白参与免疫信号通路。为全面了解CD28的相互作用网络，研究人员进一步在STRING和BioGRID数据库中查询了上述28种蛋白的相互作用蛋白，获得93种蛋白质，高度富集在细胞内信号级联和肌动蛋白-细胞骨架组织中。研究还发现，扩展的CD28相互作用网络围绕PI3K家族、STAT家族、GRB2、CD2AP、CIN85以及CBL等蛋白质形成清晰的磷酸化依赖性相互作用中心。Carlson等［14］比较了3种不同的非离子型表面活性剂（DDM、N，N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物和辛基-β-D-葡萄糖苷）以及1种离子型表面活性剂（脱氧胆酸钠）对大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）MPCs的提取效果，基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色对内膜蛋白质标记物MsbA提取效率的评价，最终选择DDM为最佳提取体系。Lorenzen等［15］使用DDM裂解HEK293细胞，并通过在膜蛋白质周围形成胶束环境，维持了GPCR-RAMP复合物在提取过程中的结构完整性。Lee等［16］研究了DDM和辛基葡萄糖苷对前列腺癌细胞PC3-mm2中膜蛋白质Cad11复合物提取的影响，发现DDM不会干扰mAb 1A5与Cad11的结合，而辛基葡萄糖苷则会干扰二者结合。以DDM提取分离PC3-mm2细胞中的Cad11复合物，通过胶上酶解-MS分析复合物中的蛋白质。使用1%FDR检索并扣除常见污染蛋白，重复鉴定出20种Cad11相互作用蛋白质。此外，通过iTRAQ定量分析比较了DDM、Triton X-100和胆酸钠对Cad11复合物的提取能力，发现DDM和Triton X-100对已知的Cad11相互作用蛋白质的提取能力相当，均优于胆酸钠（图1）。
图1 基于表面活性剂的Cad11复合物提取及其相互作用蛋白分析［16］Fig．1 Experimental flowchart for extraction of Cad11 complexes by detergents and analysis of interacting proteins［16］
尽管非离子型表面活性剂目前应用最为广泛，但该类溶剂的温和性质影响了其对MPCs的提取能力［12，17］。因此，采用多种表面活性剂的组合逐渐受到人们关注。Greenblatt等［17］利用Triton X-100、DDM和八甘醇单正十二烷基醚3种表面活性剂的组合，从酿酒酵母中鉴定了1 726种由膜蛋白参与的PPIs以及501种MPCs。Emili等［18］采用上述相同的组合从E.coli中提取，并结合亲和纯化MS分析，不仅鉴定了785种MPCs，而且从鉴定到的蛋白质相互作用网络中发现了新的复合物。尽管上述研究采用表面活性剂的组合在一定程度上提高了MPCs的鉴定覆盖率，但对复合物的稳定性仍有影响，并增加了蛋白质聚集的可能性［9，19-21］。
以SDS为代表的阴离子型表面活性剂，其长烷基链尾部可与蛋白质的疏水区相互作用，而带负电的亲水头部与蛋白质侧链正电荷结合，可协同促进对蛋白质的溶解和提取能力。然而该类表面活性剂的提取能力强，会破坏PPIs，因此无法直接用于MPCs的提取和分析。化学交联可通过在近端氨基酸残基之间形成共价键来捕获瞬态蛋白质相互作用，有效地固定低亲和力与瞬时蛋白质相互作用［22］。化学交联与MS的结合已成为获得蛋白质复合物动态构象和相互作用界面的强大技术［23-24］。Bruce等［25］报道了蛋白质相互作用报告基因（Protein interaction reporter，PIR）技术，其交联剂结合胺基反应基团、MS可断裂和亲和富集标签，且具有透膜性；
进一步将PIR交联用于多药耐药鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，A.baumannii）菌株AB5075中蛋白质相互作用的原位解析［26］。交联后采用4%SDS裂解，MS分析鉴定了2 068对交联肽，包含245种分子内和398种分子间相互作用，涉及94种膜蛋白、230种可溶性蛋白和103种未表征的蛋白。其中MPCs构成了725对交联肽，为膜蛋白质相互作用结构解析提供了数据支撑。此外，Gao等［27］开发的一种双琥珀酰亚胺酯交联剂BSP具有细胞膜通透性，可在5 min内实现活细胞内蛋白质复合物的高效快速交联。借鉴该思路，可以设计合成具有不透膜性，且对膜蛋白具有强反应活性的交联剂，通过化学交联的方式先在活细胞水平原位固定MPCs的PPIs，再采用SDS等具有强提取能力的溶剂体系提取蛋白质复合物，有望为实现MPCs的深度覆盖分析提供新的策略。
对于大多数生物学研究来说，为了分离感兴趣的MPCs，依赖非离子型表面活性剂提取的方法使用较为广泛，但它们形成的胶束环境与天然细胞膜之间的物理性质还存在一定差异，难以兼顾MPCs的高效溶解和结构的稳定。可考虑改变表面活性剂中烷基链长或组合不同功能基团，开发新型表面活性剂，在保证提取效率的前提下，提高MPCs的稳定性。
离子液体（Ionic liquids，ILs）是指在低于100℃时呈现液态的有机熔融盐类，由大且不对称的有机阳离子和有机/无机阴离子组成［28-32］。作为新兴的绿色、可设计、环境友好的溶剂，ILs因具有溶解能力强、结构可设计性等优点，近年来已被用于蛋白质提取等研究中。在前期工作中，本课题组通过对不同结构ILs的分子动力学模拟和实验评价，筛选出适用于蛋白质组高效提取且与后续胰蛋白酶酶活兼容的IL—1-十二烷基-3-甲基咪唑氯化物（1-Dodecyl-3-methylimidazolium chloride，C12Im-Cl），并建立了深度覆盖的膜蛋白质组和全蛋白质组分析方法［33-37］。然而由于C12Im-Cl与蛋白质间的相互作用力强，在蛋白质复合物提取过程中会破坏其结构的稳定性。
Chu等［38］筛选出能够保持PPIs稳定性的IL—三乙胺乙酸盐（Triethylamine acetate，TEAA），并通过分子对接模拟，发现TEAA会占据蛋白质之间的反竞争性结合位点，通过疏水相互作用和盐桥维持PPIs稳定。基于此，发展了TEAA辅助NP-40的提取体系i-TAN，提高了对MPCs的提取能力。与传统的NP-40提取体系相比，采用i-TAN体系可将从HeLa细胞中鉴定的EGFR相互作用蛋白数目由73种提高到90种。此外，从曲妥珠单抗敏感和耐药的乳腺癌细胞中鉴定到74种EGFR相互作用蛋白质，其中13种蛋白质在敏感细胞中丰度更高，41种蛋白质在耐药细胞中丰度更高。生物信息学分析发现，除了ERBB信号通路及其下游PI3K通路的激活会影响曲妥珠单抗治疗响应以外，AP-2接头复合蛋白的上调也会促进网格蛋白介导的内吞作用，使得ERBB2的表达和下游信号通路的活性下调，导致曲妥珠单抗耐药细胞对曲妥珠单抗的响应不佳，为理解乳腺癌曲妥珠单抗耐药机制提供了新的思路。此外，Chu等［39］将定量蛋白质组学技术用于肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）索拉非尼耐药机制研究，发现在Huh7耐药细胞中膜蛋白质FOLR1显著高表达；
进一步利用i-TAN体系提取结合co-IPMS分析，鉴定到124种FOLR1相互作用蛋白。对FOLR1相互作用蛋白质进行了分析以及后续生物学验证，发现FOLR1过表达可能影响叶酸异常转运，促进细胞自噬，进而引起索拉非尼耐药，为通过抑制FOLR1预防索拉非尼耐药提供了新的思路。
与传统的表面活性剂提取体系相比，离子液体辅助的提取方法形成的胶束环境更加均一，并且可占据蛋白质之间的结合位点，促进MPCs的稳定和提取。基于离子液体阴阳离子结构的可设计性，结合分子对接等理论模拟技术，有望筛选最优化的离子液体，并建立基于离子液体（不含表面活性剂）的MPCs提取体系。
以尿素为代表的变性剂通过氢键、疏水相互作用和静电作用等促进蛋白质分子氨基酸残基的伸展，从而改变蛋白质的高级结构，实现蛋白质的溶解和提取［40-42］。由于变性剂会破坏蛋白质的结构使PPIs发生变化，因此无法直接用于MPCs的提取。Wang等［23］先通过具有透膜性的甲醛交联细胞内的蛋白质复合物，然后使用8 mol/L尿素提取，并结合尺寸排阻色谱（Size exclusion chromatography，SEC）分离和数据非依赖性采集MS分析，从HEK293细胞中共鉴定到272种蛋白质复合物。Bruce等［43］将定量化学交联应用于紫杉醇处理的SILAC标记HeLa细胞，再采用8 mol/L尿素进行提取，分析细胞中的蛋白质相互作用组变化。通过SILAC定量分析获得了746种交联蛋白中683种的相对丰度水平。对关键蛋白进行分析，发现其中定位于质膜且在酪氨酸激酶信号通路中起作用的PHB蛋白与PHB2蛋白之间有8对交联肽。此外，研究发现交联水平的变化大于PHB或PHB2蛋白水平的增加，这可能表明PHB-PHB2复合物水平增加或反映了亚细胞定位的变化。Huang等［44］先利用开发的具有透膜性、可富集性和MS可断裂性的交联剂Alkyne-A-DSBSO对HEK293细胞交联后，再采用8 mol/L尿素进行提取，鉴定到2 484种蛋白质（接近12%的蛋白质具有质膜定位）之间的6 439种相互作用。上述研究为挖掘生物体内MPCs原位信息以及构建实时、准确的蛋白质相互作用网络提供了基础数据。
化学交联固定化天然的MPCs后再提取的方法，为原位解析MPCs的组成提供了新方案。虽然能够用于蛋白质组学分析，但难以获得天然的膜蛋白复合物用于其他的生物学应用。因此，仍亟需发展新型高效的MPCs提取技术，用于提升MPCs的提取效率和MPCs结构稳定性，以适应蛋白质组学和生物学研究的需求。
近年来由于可提供保持MPCs稳定的微环境，磷脂纳米盘和两亲聚合物等膜模拟两亲物在MPCs结构和功能研究中发挥了重要作用。
磷脂纳米盘是由双层磷脂组成的合成双层系统，如棕榈酰-油酰-磷脂酰胆碱被2个相同的两亲性α-螺旋膜支架蛋白包围，提供面向脂质的疏水表面和面向溶剂的亲水表面，可用于稳定被组装的MPCs［45-47］。磷脂纳米盘高度溶于水，为研究配体与膜蛋白以及PPIs的结合活性创造了类似天然的脂质环境，已被成功用于E.coli核糖体质膜上的SecYEG复合物的冷冻电镜结构表征［48］。磷脂纳米盘可通过使用不同长度的膜支架蛋白以满足对不同尺寸的膜蛋白质稳定需求，然而较大的磷脂纳米盘（直径＞15 nm）通常较不稳定［4］。为解决这一问题，Carlson等［14］开发了一种新型膜模拟支架——肽盘来保持MPCs的稳定性，并采用DDM实现了E.coli膜蛋白相互作用组的提取。在最大限度保证MPCs提取效率和结构稳定性的前提下，共鉴定到1 209个蛋白质（含591种膜蛋白）组成的4 911种相互作用，其中包含很多新发现的和瞬时的PPIs，在细胞包膜的运输过程和生物发生机制中发挥重要作用。
两亲聚合物通过在跨膜区域周围形成致密层实现MPCs的提取和稳定［4］。已有研究将两亲聚合物用于牛线粒体超复合物Ⅰ中电子传递链组分的Ⅰ1Ⅲ2Ⅳ1的提取；
其可与膜蛋白紧密结合，覆盖1．5~2．0 nm层中的疏水表面积，稳定膜蛋白并保持其在溶液中的活性，有助于后续对复合物进行结构解析［49］。Dörr等［50］利用两亲共聚物—苯乙烯-马来酸共聚物（Styrene-maleic acid copolymers，SMAs）直接从E.coli膜中分离了四聚体钾通道KcsA。SMAs不会完全破坏脂质双层，而是自发地插入并提取完整的膜片；
其形式为纳米大小的盘状颗粒，可保留原始的生物膜组分。此外，SMAs能够直接提取含有大型功能性蛋白质复合物（如参与细胞分裂［51］和光合作用［52］的蛋白质，以及ABC转运蛋白家族的成员［53］）的天然磷脂纳米盘。Korotych等［54］利用SMAs从植物类囊体中分离超分子MPCs。通过考察12种具有不同物理化学性质的SMAs从菠菜类囊体膜中提取MPCs的能力，发现SMA® 1440、XIRAN® 25010、XIRAN® 30010、SMA®17352和SMA®PRO 10235的效率最高；
进一步用于从菠菜和豌豆类囊体膜中分离超分子MPCs，发现XIRAN® 30010和SMA® PRO 10235相较于其他3种，偏向提取具有较小尺寸或较低密度的MPCs（图2）。
图2 基于5种SMAs的菠菜和豌豆类囊体膜中超分子MPCs的提取［54］Fig．2 Extraction of supramolecular MPCs from Spinacia oleracea and Pisum sativum by five SMAs［54］
新型膜模拟两亲物的开发，譬如通过在磷脂纳米盘内重建膜模拟环境，或使用SMA保护MPCs局部的膜环境，均取得了显著的效果，并且与冷冻电镜兼容，有助于实现特定MPCs的提取和结构解析。但目前尚无法模仿整个膜环境，还有待开发更大尺寸且稳定的膜模拟两亲物。
超声处理是采用不同频率的声波交替破坏细胞结构，从而提取蛋白质。近年来，Robinson等［55-56］报道了在维持细胞膜完整性的前提下，适用于MS分析的脂质囊泡超声处理方法（Sonication of lipid vesicles for mass spectrometry，SoLVe-MS）。利用不同来源的膜制备脂质囊泡，在醋酸铵中进行超声处理，破坏并浓缩包裹MPCs的囊泡，将其引入质谱仪中电离，进而实现MPCs的原位质谱解析（图3）。该研究可揭示天然膜中未被表征的相互作用，譬如E.coli外膜中FOF1ATP酶-SecYEG复合物（与FO中的c亚基结合），以往研究显示其在表面活性剂提取过程中丢失或在其他方法中被过滤掉［57］；
发现E.coli内膜中CydX和AppX能够同时与CydAB相互作用形成异源四聚体。此外，还在牛线粒体内膜中鉴定到复合物Ⅲ和Ⅳ。研究结果体现了天然膜环境对于保留膜蛋白质组的小分子结合、亚基相互作用和相互作用蛋白的重要性。
图3 E.coli内外膜上SoLVe-MS分析的关键步骤［56］Fig．3 Key steps in the process of SoLVe-MS performed on E.coli inner and outer membranes［56］
该方法无需传统的化学干预及处理（例如使用表面活性剂），也无需构建复杂的MPCs过表达体系，为MPCs解析提供了新的思路。值得注意的是，尽管这些天然膜囊泡尽可能地模拟蛋白质的天然环境，但它们并未完全概括天然膜的所有特性。此外，一些膜囊泡很难纯化或大量生产，如真核细胞质膜，可能过于复杂而无法分析。随着样品变得更加复杂并由更多的蛋白质组成，将需要大量的生物材料。这可能会成为该方法使用受限的原因之一。
MPCs因其所处的天然膜环境相对疏水，在提取过程中易解离，稳定性较差。本文介绍了5种MPCs提取方法，其中基于非离子型表面活性剂和离子液体辅助的提取方法可以很好的与生物学研究兼容，促进MPCs关键生物功能的挖掘；
基于化学交联固定化后再提取以及超声处理的方法为深度覆盖的原位膜蛋白相互作用解析提供了新的策略；
基于膜模拟两亲物的提取方法为MPCs的结构解析提供了有力支撑。针对不同方法的适用性，可根据需求选择合适的提取方法。目前对于MPCs的提取和鉴定还明显落后于可溶性蛋白质，在未来研究中，整合多种提取方法实现MPCs的深度覆盖分析，解析全景式膜蛋白相互作用组值得进一步探索。此外，针对分布在特定亚细胞器的MPCs以及特定功能性MPCs的提取，还需要开发相应的靶向提取策略，不仅要具备足够的提取能力和维持复合物中PPIs的稳定性，而且要提升对特定MPCs的靶向选择性。随着提取方法的不断发展，对MPCs的鉴定和认识也会逐步深入，将会发现更多与疾病相关的靶标膜蛋白质，为临床药物开发提供理论支撑。